Biomoleculaire Detectie gebruik de interferometrische reflectie Imaging Sensor (IRIS)

1. Voorbereiding van de ondergrond Coat gelaagde silicium-SiO 2 substraten met self-adsorberende copoly (DMA-NAS-KAARTEN): Copolymeer synthese, chemische structuur, en coating proces zijn gepubliceerd in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Karakterisering van een polymeer Geadsorbeerd Coating voor DNA Microarray Glass dia's. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. Kortom, voor te bereiden polymeeroplossing door het toevoegen van 100 mg van polymeer tot 5 ml gedeïoniseerd (DI) water en voeg 5 ml van 40% verzadigd ammoniumsulfaat ((NH 4) 2SO 4)-oplossing tot een uiteindelijke concentratie van 0,92 M. te bereiken Dompel chips in oplossing gedurende 30 minuten op een shaker en daarna grondig afspoelen met DI-water. Droog ze grondig met Argon / N 2 gas. Bak frites bij 80 ° C gedurende 15 minuten. Store polymeer gecoate substraten / chips in een droge omgeving (vacuüm exsiccator) voor maximaal 3 maanden tot probe spotten procedure. 2. Voorbereiding van de Probe Array: antilichamen, antigenen, ss / dsDNA, RNA, enz. Verdunnen sonde (s) aan de juiste concentratie in de gewenste buffer. Deze stap kan aanzienlijk worden variëren, maar een typisch experiment maakt gebruik van antigeen of IgG bij een concentratie van 0,5 mg / ml (bereik van 0,1 -1 mg / ml) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH ≈ 7,4. Plaats oplossingen in een 96 – of 384-wells plaat (of standaard bron plaat voor de spotter gebruikt) Setup spotten parameters voor de gewenste gekleurde array: bepalen van de juiste parameters voor het spotten van de oppervlakte en oplossingen worden gebruikt (dwell tijden, naderingssnelheden, etc.). Bepaal het aantal herhalingen van elke conditie per grid, de grid lay-out, het aantal repliceren netten, en de gewenste spotten locatie op de chip. Plaats substraten en de bron plaat op de juiste locaties, controleer dan of afval en aanbod flessen klaar voor zijn, en beginnen met afdrukken uit te voeren. Na het spotten is afgewerkt plaats substraten in een vochtige omgeving 's nachts (4-18 uur) om immobilisatie en uitschakelen proces door te gaan. Was ondergronden: plaats ze in de volgende oplossingen voor drie minuten voor drie afzonderlijke wasbeurten: PBS met 0,1% Tween (PBST), PBS, en tenslotte gedeïoniseerd (DI) water. Afhankelijk van het type van het experiment (nat vs droog), droog de chip met Argon gas en te beginnen incubatie of plaats de chip in een stromingskamer en te monteren. Deactiveer de resterende NHS groepen aan copolymeer oppervlak door onderdompeling van de chips in een 50 mM oplossing van ethanolamine met de pH ingesteld op 7,4 gedurende 30 minuten tijdens een shaker plaat. Een primaire amine-bevattende verbinding, zoals hydroxylamine of Tris kan ook worden gebruikt, zolang de bereide oplossing is veilig te gebruiken met eiwitten. Spoel de deactivering oplossing met behulp van PBS dan DI-water. Optionele stap (afhankelijk van de oppervlakte chemie wordt gebruikt): Block oppervlak met behulp van een oplossing van BSA, caseïne, of gerehydrateerd melk gedurende 30 minuten. Voor de huidige polymere oppervlakte chemie die we gebruiken, doen we niet uitvoeren van deze stap als het polymeerskelet daden om te voorkomen dat niet-specifieke eiwit binding. 3. Data Acquisition en Incubatiecentrum Procedure: Endpoint formaat Maak een oplossing van het doelwit van belang in de gewenste buffer. Hier zal het een oplossing van de juiste concentratie van anti-BSA in PBS (ex: maak 1-10 ml van een 10 ng / mL oplossing van Anti-BSA in PBS). Zorg er ook voor om een ​​equivalente hoeveelheid buffer (zonder doel) hebben voor de negatieve controle incubatie. Neem een ​​silicium spiegel scan voor het normaliseren van alle verzamelde gegevens vervolgens. Scan de voorbereide probe array met het IRIS-systeem voorafgaand aan de incubatie stap om de eerste optische hoogte (massa) op elke plek te bepalen. Dit zal zorgen voor een goede analyse van veranderingen in de massa aan de oppervlakte, dat wil zeggen het niveau van de binding, na de incubatie. Hier zal een paar parameters worden aangepast voor het huidige experiment, zoals de belichtingstijd, gezichtsveld, die gedijt scherpstellen, etc. Dompel chip (s) in bereide oplossing voor 1 uur op een shaker plaat. De incubatietijd kan variëren aanzienlijk afhankelijk van het niveau van agitatie, de concentratie van de doelstelling wordt gedetecteerd, het transport eigenschappen van de stroming kamer (als een real-time detectie mode wordt gebruikt), de affiniteiten van de target-probe paar, enz. . Na de incubatie, herhaal dan de procedure was zoals beschreven in stap 2.5) Scan van dezelfde probe array met het IRIS-systeem en het verkrijgen van post-incubatie beelden voor pre-incubatie vergelijking. Herhaal dit proces voor de verschillende incubatie stappen, indien nodig, bijvoorbeeld in een sandwich-test format waarbij een secundair antilichaam wordt gebruikt. 4. Data Analysis Passen de verzamelde beelden voor elk IRIS scan (volgorde van de intensiteit beelden), met behulp van de lab-ontwikkelde software om proDuce een beeld van de sonde array met optische dikte informatie. Een snelle kwalitatieve analyse van de binding kan worden uitgevoerd door het aftrekken van (aangetekende) post-en pre-incubatie beelden. Bindend zal verschijnen als een verandering in de intensiteit op die plekken waar de massa veranderingen waargenomen. Voor de kwantitatieve analyse, bepalen de massa dichtheden van elke plek ten opzichte van de achtergrond door het gemiddelde optische dikte informatie voor elke pixel in een plek en een ring buiten de plek en het maken van een directe vergelijking van deze twee gebieden. 5. Representatieve resultaten: Figuur 1 toont een voorbeeld schema van de gelaagde Si-SiO 2 IRIS substraat gespot met een vertegenwoordiger van antilichaam array. Elk antilichaam ensemble is gespot in repliceren met specificiteit voor een ander epitoop gericht is op verschillende eiwitten. Twee verschillende gehele virussen en een viraal eiwit worden vertegenwoordigd als voorbeeld doelen. Negatieve controle antilichamen zijn afhankelijk van de test en kan niet-specifieke en / of virus-specifiek zijn. Figuur 2 toont de binding van humaan serumalbumine (HSA)-specifieke antilichamen tegen een reeks van gevlekte HSA en konijnen-IgG (controle) vlekken. Zoals hier te zien, na montage en bepaling van de optische diktes voor de pre-en post-incubatie beelden, kan een verschil afbeelding voor de binding array gecreëerd om de kwalitatieve evaluatie van binding. Kwantitatieve analyse blijkt dat een 2,05 en 0,13 nanometer betekenen optische hoogte verandering werd waargenomen voor de HSA en het konijn IgG plekken respectievelijk, voor een anti-HSA incubatie concentratie van 500 ng / mL. Figuur 3 toont een IRIS-meting van Fur eiwitbinding afhankelijkheid van eiwit concentratie en dsDNA oligomeer lengte. De bovenste grafiek toont absolute optische hoogtemetingen voor de eerste geïmmobiliseerd oligomeer sonde hoogtes en post-incubatie Fur bindend. Toenemende concentraties van Fur (50, 100, 200 nM) resulteerde in een verhoogde binding aan DNA-sondes. De lengte van de oligomeren heeft ook invloed op Fur binding met een langere sequenties resulteert in meer bindend. Hier, error bars geven een standaarddeviatie van het gemiddelde. De onderste grafiek toont berekend Fur eiwit dimeer binding per dsDNA streng. Dimeer binding werd significant verhoogd bij een Fur eiwit concentratie van 200 nM wijst op een hoog niveau van niet-specifieke binding. Figuur 1. Schematische voorstelling van een voorbeeld probe-array die gewoonlijk worden gebruikt in een experiment om specifieke virussen en virale componenten op te sporen in een multiplexed mode met het IRIS-systeem. Figuur 2. Post-incubatie verschil de afbeelding voor een binding van humaan serum albumine-specifieke antilichamen tegen gespot HSA verzameld met dit label-free-systeem bij een concentratie van 500 ng / mL. Het biomateriaal massadichtheid voor elke plek wordt bepaald door het gemiddelde optische dikte van informatie binnen een plek en vervolgens deze te vergelijken met het gemiddelde van een ring rond de plek die de achtergrond. Figuur 3. Perceel van bindende gegevens voor Fur eiwit interacties met gevlekte double-stranded oligomeren met een bekende consensus sequentie op basis van oligomeer lengte, de locatie van de consensus sequentie binnen het oligomeer en Fur eiwitconcentratie. Informatie over de absolute hoeveelheid van de Fur-eiwit gebonden aan elke gespot volgorde (top) kan worden gebruikt om het aantal Fur dimeren gebonden aan elk type van oligomeer (onder) te schatten.