הפלישה של תאים אנושיים על ידי פתוגן חיידקי

פרוטוקול הבא יתאר את המחקר של הפלישה תא האנדותל ש ' aureus אבל תיאורטית יכול לשמש כדי ללמוד הפלישה הסלולר על ידי חיידק כלשהו culturable. ספציפית ס שלבים בתאי האנדותל aureus ו מסומנים. 1. הכנה של חיידקים תרבות S. aureus זנים של 4-16 שעות (תלוי שלב הצמיחה חובה) ב 10 Brain-Heart מרק מ"ל (BHI) עירוי ב 37 מעלות צלזיוס באוויר עם רועד בסל"ד 200. אלה התנאים לצמיחה הן ספציפיות עבור ס aureus ו – ייתכן שיהיה צורך להתאים לחיידקים אחרים. לשטוף חיידקים שלוש פעמים בינוני השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM; Invitrogen) על ידי סיבובים חלופי של צנטריפוגה בטמפרטורת החדר (5000 x גרם, 10 דקות), הסרת supernatant התרבות resuspension של גלולה חיידקי בהיקף שווה ערך של DMEM. מדוד את צפיפות אופטית של ההשעיה של חיידקים וכתוצאה מכך אשר לאחר מכן ניתן להתאים לפי הצורך. עבור ס aureus, אנו מכינים השעיה על OD 600 = 1, אשר מתאים ~ 10 9 CFU -1 מ"ל. 2. תא האנדותל תרבות תרבות קו תא האנדותל EA.hy926 1 ב DMEM בתוספת העובר שור בסרום (FBS; 10%) ו-L-גלוטמין (2 mM) ב 37 ° C ב 5% CO 2. לחלופין, ונקווה העיקרי האדם וריד הטבור לתאי אנדותל (HUVECs) ניתן לרכוש Lonza (באזל, שווייץ) ו בתרבית בינוני הבסיס אנדותל בתוספת 2% FBS, תמצית מוח שור (כולל הפרין), גדילה אנושי גורם האנדותל הידרוקורטיזון ב 37 מעלות 5% CO 2 על פי ההוראות של היצרן (Lonza). אלה התנאים לצמיחה ספציפיים עבור תאים אלה ייתכן שיהיה צורך להתאים את סוגי תאים אחרים המארח. לגדול לתאי אנדותל ב T75 צלוחיות להשלים confluency, מאומת על ידי העין. הכן את 24 גם צלחות להכנסה של coverslips. מלקחיים פיין (להבה מעוקרים) יש צורך להעביר את coverslips, אשר יש משטח אחד מבריק אטום אחת. המקום coverslips בבארות של צלחת 24 היטב עם משטח אטום כלפי מעלה כדי לאפשר התקשרות לתא. שחרר את התאים מן הבקבוק T75 עם 3 מ"ל טריפסין-EDTA (0.25%), ולהוסיף 10 מ"ל של המדיום תרבות הרלוונטיים. הוסף 500 μl של תאים resuspended ל 24 גם צלחות המכילות coverslips Thermanox זכוכית. אחת T75 בקבוק ומחוברות של תאים תאים סיפק מספיק עבור שני 24 גם צלחות, וכתוצאה מכך כ 5 × 10 5 תאים לכל טוב (בינוני 500 μl). דגירה צלחות עבור 48 שעות כפי שתואר לעיל, ולוודא 100 תא% confluency על ידי מיקרוסקופ אור הפוכה. טובלים לשטוף coverslips ב PBS ולהוסיף 24 גם צלחות חדשות המכילות 490 DMEM μl FBS המכיל 10% בכל טוב. כדי לבחון את תפקידה של תהליכים מטבוליים ספציפיים הפלישה התא, מעכבי ניתן להוסיף תאים בתרבית 1 שעות לפני תוספת של חיידקים בריכוזים נשמר במהלך assay. לדוגמה, כדי לקבוע את התפקיד של סידור מחדש של אקטין ס הפלישה aureus של בתאי האנדותל, 50 מיקרומטר cytochalasin D ניתן להוסיף, או לתפקיד של caveolae, 5 מ"מ methyl-β-cyclodextrin ניתן להוסיף. 3. הפלישה Assay הוסף 10 μl של חיידקים שטף (וכתוצאה מכך כ 2 × 10 7 CFU מ"ל aureus -1 ס) זה טוב המכיל coverslip שטף בשכבה ומחוברות של בתאי האנדותל ב 490 DMEM μl המכיל 10% FBS. דגירה של 15-90 דקות 37 ° C ב 5% CO 2. כדי למדוד את המספר הכולל של חיידקים הקשורים התאים (חסיד והפנימו), לטבול, לשטוף את coverslips שלוש פעמים PBS ולהוסיף בארות טרי המכיל 500 טריטון 0.5% μl X-100 ב PBS. כדי להבטיח את התאים באופן מלא lyse ולשחרר את כל החיידקים הפנימו, פיפטה מספר פעמים, מצביע על קצה פיפטה ישירות על פני השטח של coverslip. ספירת החיידקים על ידי ציפוי ההשעיה נוזלי (או דילולים זה במידת הצורך) על פני השטח של צלחות TSA. מאז TX-100 יהיה lyse רבים חיידקים גראם שליליים, saponin יכול לשמש במקום 2. כדי למדוד את מספר החיידקים הפנימו, להסיר את supernatant תרבות מכל המכיל חיידקים מאוגד היטב ולהחליף 500 μl DMEM/10% FBS בתוספת 200 מיקרוגרם מ"ל -1 גנטמיצין. אנו משתמשים באופן שגרתי גנטמיצין ולא lysostaphin כאן כפי שהוא זול יותר מאפשר לנו לעבור בין הניסויים באמצעות סוגים שונים של חיידקים (למשל Staphylococci ו Lactococci) מבלי לשנות את פרוטוקול הניסוי. דגירה צלחות על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO 2 דקות 60 להרוג את כל החיידקים תאיים. לשטוף coverslips 3 פעמים PBS,lyse ו למנות על ידי ציפוי על גבי ה-TSA, כמתואר עבור assay את הידבקות לעיל. במקרים מסוימים זה עשוי להיות עדיף על פני חזותית לספור את מספר החיידקים באמצעות מיקרוסקופ אור. במקרה זה, והן ספציפיות ס תא הפלישה aureus, להשתמש lysostaphin (10 מיקרוגרם מ"ל -1) במקום גנטמיצין פיזית להשמיד את החיידקים תאיים. דגירה coverslips עבור 20min ב 37 ° C ב-CO 2 בתמיסה lysostaphin, ולאחר מכן לשטוף ולתקן עם Cytopath (Cellpath). המבול coverslips עם קריסטל סגול (0.5% w / v) עבור 5min. טובלים לשטוף במים, האוויר יבש לעלות על שקופיות הזכוכית. מספר חיידקים לכל מ"מ 2 של בתאי האנדותל ומחוברות ניתן לכמת באמצעות מיקרוסקופ אור. 4. נציג תוצאות: ביטוי של חלבונים מחייב פיברונקטין (FnBPA ו FnBPB) על פני השטח של ס aureus מקנה את היכולת לפלוש לתאי אנדותל. מחקר שנערך לאחרונה מחדש את תחום פיברונקטין מחייב של FnBPA 3. Wild-type (WT) ס aureus 8325.4 פולש לתאי אנדותל עם יעילות גבוהה, תוך זן חסר הן FnBPA ו-B (Δ fnb) הראו רמות נמוכות משמעותית של internalisation (איור 1A). השלמה של מוטנטים עם fnb קידוד פלסמיד מינוס תחום פיברונקטין מחייבים (pFnR0) לא לקדם פלישה (איור 1A). לעומת זאת, השלמה של מוטנטים בקידוד פלסמיד fnb כל הגן (pFnBA4) משוחזר הפלישה לרמות WT (איור 1A). תפקידה של FnBPA בפלישה תא האנדותל יכול להיות גם הדגימו באמצעות לארח את הביטוי Heterologous lactis Lactococcus. ביטוי של הפלסמיד המקודד FnBPA ב L. lactis (pRM9 9) לא לשפר באופן משמעותי את הידבקות לתאי אנדותל לעומת חיידקים להביע שום FnBPA (CTL) (ברים פתוחים, 1B איור). לעומת זאת, ל-לבטא FnBPA lactis פלשו לתאי אנדותל ברמות גבוהות משמעותית המתח לא הביע (ברים סגור, 1B איור). הניסויים בוצעו ארבע פעמים כפולות סטיית תקן ממוצע ± מוצג. * מייצגים נתונים שאינם שונים באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית (p = <0.05) מ WT או ערכים CTL. באיור 1. הפלישה של EA. Hy926 לתאי אנדותל ש ' aureus (א) או ל lactis (B).