الداخلي للهندسة الرئة
Özet
قمنا بتطوير مصفوفة الرئة decellularized خارج الخلية ومفاعل حيوي رواية بيوميمتيك التي يمكن استخدامها لتوليد أنسجة الرئة وظيفية. قبل البذر الخلايا في المصفوفة والتثقيف في مفاعل حيوي ، ونحن توليد أنسجة الذي يوضح التبادل الفعال للغاز عند زرعها في الجسم الحي لفترات قصيرة من الزمن.
Abstract
أنسجة الرئة ، بما في ذلك سرطان الرئة وأمراض الرئة المزمنة مثل مرض انسداد الشعب الهوائية المزمن ، حساب تراكمي لبعض الوفيات 280000 سنويا ؛ مرض انسداد الشعب الهوائية المزمن هو رابع سبب رئيسي للوفاة في الولايات المتحدة (1). المساهمة في هذه الوفيات هو حقيقة أن الرئتين لا إصلاح أو تجديد عموما يتجاوز المستوى المجهري الخلوية. لذا ، لا أنسجة الرئة التي تضررت من انحطاط أو العدوى ، أو أنسجة الرئة التي هي محل مقطوعة جراحيا وظيفيا في الجسم الحي. لاستكشاف ما إذا كان يمكن أن تتولد أنسجة الرئة في المختبر ، نعامل الرئتين من الفئران البالغين باستخدام إجراء من شأنه أن يزيل المكونات الخلوية لإنتاج رئة خارج الخلية ديكي مصفوفة السقالة. هذه السقالة يحتفظ الهياكل الهرمية المتفرعة من المجاري الهوائية والأوعية الدموية ، فضلا عن الغشاء القاعدي سليمة إلى حد كبير ، الذي يضم الكولاجين الرابع ، laminin وفبرونيكتين. هي التي شنت على سقالة في مفاعل حيوي صمم لتقليد الجوانب الحاسمة في الفيزيولوجيا الرئة ، مثل التهوية الضغط السلبي والتروية الوعائية نابض. ظهارة بواسطة زرع بطانة الأوعية الدموية الرئوية وداخل مفاعل حيوي سقالة محمولة ، ونحن قادرون على توليد أنسجة الرئة التي هي مماثلة لأنسجة الرئة phenotypically المحلية والتي هي قادرة على المشاركة في تبادل الغازات لفترات زمنية قصيرة (45-120 دقيقة). هذه النتائج مشجعة ، وتشير إلى أن إعادة تعمير مصفوفة الرئة هو استراتيجية قابلة للتجديد الرئة. هذا الاحتمال فرصة ليس فقط للعمل من أجل زيادة المعروض من أنسجة الرئة للزرع ، ولكن أيضا لدراسة الخلية في الجهاز التنفسي والبيولوجيا الجزيئية في المختبر لفترات أطول في المكروية وأكثر دقة مما كان ممكنا في السابق.
Protocol
Discussion
قدم أهم جوانب النظام وتشمل الصيانة هنا من العقم ، والرصد الدقيق من الضغوط التي تمارس على السرير الأوعية الدموية في جميع مراحل عملية إعداد وبذر السقالة وزراعة الرئة إسكانها. يتم الاحتفاظ أفضل العقم بواسطة التعقيم جميع المواد قبل استخدامها ، وتركيب الرئة في نظام مغلق ، وبعد فترة وجيزة يزدرع تجنب خرق لاحق من هذا الحاجز. بعد المصفوفة decellularized تشطف جيدا ونقلها الى مفاعل حيوي للثقافة عقيمة ، لا ينبغي غطاء سيليكون والأختام وغيرها من الاتصالات ان ينزعج أو إزالتها. للحفاظ على الضغط في الاختيار ، وتدفق مدفوعا الجاذبية هي الأفضل كلما أمكن ذلك. عندما يطلب إلى مضخة لإعادة تدوير السوائل ، تبدأ بعد الشطف مع استمرار برنامج تلفزيوني وخلال الثقافة ، ونوصي قياس الضغط مباشرة قبل قليل من السائل يدخل في الشريان الرئوي مع محول الضغط. وينبغي أن حجم الضغوط التي مورست لا تتجاوز ال 15 ملم زئبق.
يمكن تربيتها Recellularized الرئتين لفترات متفاوتة الزمن ، تتراوح عادة من 4 أيام لتصل إلى 3 أسابيع. عادة ما يتم إنجاز نضح في الأوعية الدموية 1-3 مل / دقيقة خلال ثقافة البطانية ، بينما يتم تطبيق التهوية عادة بمعدل 1 التنفس / دقيقة خلال ثقافة الظهارية. خلال فترات الثقافة مجتمعة ، في وقت واحد ، ونضح التهوية المناسبة. لا يمكن أن يؤديها إما مع التهوية المتوسطة السائل أو الهواء.
على مدى العقود العديدة الماضية ، قامت عدة مجموعات عمل مهمة هندسة الأنسجة تظهر جدوى التفريق ظهارة الرئة في المختبر ، وتكرار العديد من جوانب microanatomy الرئة 7،8،9 ، 10. ومع ذلك ، حتى وقت قريب ، لم يكن احد منهم 4،5 من هذه المحاولات لمهندس نسيج الرئة أدى إلى زرع الجهاز الذي كان قادرا على الحفاظ على الفصل بين الدم والتنفس والمقصورات التي يمكن أن تشارك في تبادل الغازات. لذا ، على الرغم من الأساليب المذكورة ليست سوى خطوة أولى نحو هدف طويل الأجل لتوليد أنسجة الرئة وظيفية ، وهذا العمل هو خطوة مشجعة نحو إمكانية زيادة كمية أنسجة الرئة المتاحة للزرع. وعلاوة على ذلك ، فإن هذا العمل بالتفصيل العمل الذي قام به أوت آخرون وUYGUN وزملاؤه 11،12 ، مما يدل على نجاعة المصفوفة خارج الخلية decellularized بوصفها سقالة لهندسة الأنسجة هياكل ثلاثية الأبعاد المعقدة ودعم النمو والبقاء على قيد الحياة لأنواع مختلفة من الخلايا . هذا العمل هو أيضا كبير لمساهمتها في الجهاز التنفسي أرممنتريوم الخلية والبيولوجيا الجزيئية. من خلال توفير فريدة من نوعها ، ثلاثي الأبعاد البيئة التي يمكن أن توفر أيضا مؤثرات الميكانيكية المناسبة ، والتي لا تشترك في المخاطر المصاحبة للتمايز دي السريعة التي يمكن للمرء أن تواجهها عند زراعة ظهارة القوارض في المختبر مع أكثر الأساليب التقليدية 13 ، يمكن استخدام العلماء لدينا نظام لاكتساب المعرفة الجديدة في التفاعلات خلية خلية وخلية المصفوفة التي تلعب دورا في تمايز الخلايا ووظيفتها. هذه المعرفة قد تكون قوية خاصة إذا ما استخدمت كوسيلة ضغط لتوجيه مصير السكان من مختلف الخلايا الجذعية ، ومجموعة Cortiella وأثبتت الدراسات الأولية في 14.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر Maegan باء Colehour للمساعدة في تطوير مفاعل حيوي. وتم تمويل هذه الدراسات من جانب جامعة ييل قسم التخدير والمعاهد الوطنية للصحة 098220 HL منحة (لLEN). كان مدعوما من قبل THP T32 NIH GM007171.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Euthanasia | |||
| Heparin | Sigma-Aldrich | H4784 | |
| Sodium nitroprusside | Fluka | 71778 | |
| Euthasol euthanasia solution | Virbac AH | 710101 | 390 mg/ml pentobarbital sodium stock solution should be diluted appropriately for IP administration |
| Decell Solution | |||
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C3023 | |
| NaCl | American Bioanalytical | AB01915 | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| NaOH | J.T. Baker | 3722-01 | |
| 1X PBS | Gibco | 14190 | |
| Bioreactor Components | |||
| 480 ml jar | Cole Parmer | EW-3460560 | |
| Silicone stopper, size 14 | Cole parmer | EW-06298-26 | |
| Y-connectors | Cole Parmer | ED-30614-08 | Used for arterial and tracheal cannulae |
| Silicone tubing | Masterflex | 96420-14; 16 | L/S 14; 16 |
| Pressure Transducers | Edwards Lifesciences | PX-212 | |
| Check valve | Cole Parmer | EW-98553-20 | One-way valve |
| 4-way stopcocks | Edwards Lifesciences | 594WSC | |
| Syringe filter | Cole Parmer | 2915-08 | PTFE, 0.2μm |
| Decell and rinsing apparati (additions to bioreactor) | |||
| 500 and 1000 ml glass bottles | Corning | 1395-500; -1L | Used for decell and rinsing by gravity |
| Benzonase Treatment | |||
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Tris-HCl | American Bioanalytical | AB14043 | 1M, pH 8.0 |
| MgCl2 | J.T. Baker | 2444-01 | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E1014 | Endonuclease used to remove remnant DNA from matrix |
Referanslar
- American Lung Association. . Lung Disease Data. , (2008).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., Colehour, M. B., Niklason, L. E. Bioreactor for the Long Term Culture of Lung Tissue. Cell Transplant. , (2010).
- Bilek, A. M., Dee, K. C., Gaver, D. P. Mechanisms of surface tension induced epithelial cell damage in a model of pulmonary airway reopening. J Appl Physiol. 94, 770-783 (2003).
- Petersen, T. H. Tissue-Engineerined Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329, 538-5341 (2010).
- Ott, H. C. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-9233 (2010).
- Cortiella, J. Influence of acellular natural lung matrix on murine embryonic stem cell differentiation and tissue formation. Tissue Eng. Part A. 16, 2565-2580 (2010).
- Sugihara, H., Toda, S., Miyabara, S., Fujiuyama, C., Yonemitsu, N. Reconstruction of alveolus-like structure from alveolar type II epithelial cells in three-dimensional collagen gel matrix culture. Am J Pathol. 142, 783-7892 (1993).
- Choe, M. M., Sporn, P. H., Swartz, M. A. Extracellular matrix remodeling by dynamic strain in a three-dimensional tissue-engineered human airway wall model. American Journal Respiratory Cell Molecular Biology. 35, 306-306 (2006).
- Cortiella, J. Tissue-enginered lung: an in vivo and in vitro comparison of polyglycolic acid and pluronic F-127 hydrogel/somatic lung progenitor cell constructs to support tissue growth. Tissue Engineering. 12, 1213-1213 (2006).
- Price, A. P. Development of a Decellularized Lung Bioreactor System for Bioengineering the Lung: The Matrix Reloaded. Tissue Eng Part A. , (2010).
- Ott, H. C. Perfusion-decellularized matrix: using nature’s platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14, 213-221 (2008).
- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. 16, 814-820 (2010).
- Shannon, J. M., Mason, R. J., Jennings, S. D. Functional differentiation of alveolar type II epithelial cells in vitro: effects of cell shape, cell-matrix interactions and cell-cell interactions. Biochim. Biophys. Acta. 931, 143-156 (1987).
- Cortiella, J. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng Part A. , (2010).
