Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

1. Preparação de tumorspheres retinoblastoma Obtenção de amostra de tumor retinoblastoma em um IRB-aprovado protocolo. Prepare fresca media de células-tronco definido (Neurobasal-A mídia, 1X B-27 suplemento menos vitamina A, 1X não essenciais solução de aminoácidos, L-glutamina 1X, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF). Mecanicamente desagregar o tecido tumoral com um bisturi, usando uma técnica transversal em um tecido estéril, a cultura tratados com seis bem-chapa. Imediatamente adicione 100 mL de mídia células-tronco para definir o tecido e delicadamente espalhar o tecido picada usando o bisturi. Adicionar 5 mL dos meios de comunicação de células-tronco definido para o bem. Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 em uma incubadora umidificada e inspecionar diariamente. Alguns tumorspheres deve surgir a partir do tecido tumoral interrompido quase imediatamente, com um número crescente ao longo de 2-4 dias. Semanais, tumorspheres centrifugue a 300xg por 5 minutos, ressuspender em recém-preparados media células-tronco definido, e pipeta cima e para baixo 10 vezes para interromper maior, esferas de necrose central e permitir que novas esferas saudáveis ​​a se formar. 2. Preparação de células tumorais para injecção Se injetar tumorspheres cultivadas, gentilmente esferas pipeta para um tubo de 15 mL cônico. Pipeta suavemente para cima e para baixo com uma pipeta sorológica 10-15 vezes de interromper as esferas. Contar as células a ser injetado através de um hemocitômetro, e alíquota, pelo menos, 50 mil células por injeção em um novo tubo. Prepare-se para muitos como injeções possível com base no número de células disponíveis. Centrifugar a 300xg por 5 minutos. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender em 5 mL de PBS. Repetir a centrifugação e aspiração, e ressuspender em 10 mL PBS por injeção. 3. Preparação dos animais Usando uma seringa de insulina, administrar uma injeção intraperitoneal de cocktail anestesia roedores (ketamina 37,6 mg / mL, xilazina 1,92 mg / mL, acepromazina 0,38 mg / mL) a 1 mL por grama de peso corporal (GBW). Espere 5 minutos para que o animal se sedado. Verifique se há batimento cardíaco e colocar o animal em uma almofada aquecida. Manter animais em uma almofada aquecida em todas as vezes até a recuperação. Após a sedação, administrar 1 gota de HCl proximetacaína no olho direito. Substituir animais na almofada aquecida e espere um minuto. Administrar 1 gota de fenilefrina HCl para o olho direito. Substituir o animal na almofada aquecida e aguarde 5 minutos. Se a dilatação da pupila não ocorreu, re-administrar 1 gota e esperar mais 5 minutos. Monitorar os animais em busca de sinais de movimento ou contração muscular, que pode ocorrer em> 30 minutos após a sedação. Aos primeiros sinais de movimento, administrar 1 mL / GBW de cetamina HCl (diluído a 10 mg / mL em PBS) e aguarde 5 minutos. 4. Injeção de células tumorais Coloque o animal anestesiado sob o microscópio de lado, com o olho direito para cima e com a cabeça descansando sobre uma gaze e centrado para obter um reflexo vermelho do fundo do olho direito (pupila dilatada deve ser neste momento) quando observada através do microscópio . Escorar o globo direito empurrando levemente para baixo simultaneamente com dois dedos sobre as pálpebras e mantenha esta posição de forma constante para o restante do procedimento. Usando uma agulha estéril de calibre 30 acoplada a uma seringa Luer-lock, furar o globo lateralmente através da conjuntiva e esclera adjacente ao limbo da córnea na área da pars plana (Figura 1) e apenas através da coróide na cavidade vítrea. Retire a agulha da abertura. Esterilizar a agulha Hamilton com um algodão embebido em álcool. Chamar a suspensão de células para dentro da seringa Hamilton e inserir a agulha na abertura até que a agulha é visualizado através do microscópio atrás da lente no vítreo perto da retina. Com a ajuda de uma segunda pessoa, enquanto segura a agulha firmemente nesta posição, o êmbolo lentamente. Remova a agulha. Se necessário, use um cotonete para absorver qualquer líquido da abertura. Gentilmente liberar a pressão das pálpebras para fechar as pálpebras mouse. Administrar 1 gota de hipromelose para cada olho e voltar animal para almofada aquecida para recuperação. 5. Monitoramento de camundongos injetados e colheita de tumores Diária, examine o olho injetado de leucocoria (reflexo branco papilar) e / ou distensão periocular que geralmente se torna aparente 2-4 semanas após a injecção. Uma vez que o crescimento do tumor é detectado, a eutanásia de animais de acordo com as diretrizes institucionais. Se o tumor do olho e são cobertos por pálpebras, use o bisturi para fazer duas incisões ortogonal à fenda palpebral e levante a retalhos cutâneos. Sob visualização usando o microscópio estereoscópico, faça uma incisão circunferencial no limbo, eliminando a córnea ea lente, e dissecar cuidadosamente a maior parte da massa tumoral a partir de outros tecidos usando tweezers. Coloque o tumor em estéril RPMI-1640 mídia. Use uma pinça para retirar o mundo aberto a partir do soquete. Para garantir um nervo ligado óptica para a invasão do tumor pode ser visualizado, puxe o mundo até que o nervo é exposto e usar a tesoura para cortar o nervo maior tempo possível. Coloque em formalina 10% para regular processamento para exame histológico. 6. Resultados representativos: Tumorspheres retinoblastoma começarão a aparecer a partir do tecido desagregados quase imediatamente como eles são liberados a partir da massa tumoral. Dentro de 2-4 dias, mais tumorspheres começará a forma e vai aumentar de tamanho. As esferas tendem a ser regular e exibem uma membrana bem definida, secundárias em torno do agregado (Figura 2). O animal normalmente apresenta-se com leucocoria dentro de 4 semanas pós-injeção (Figura 3b), seguido pelo alargamento do globo e distensão dos tecidos circundantes 5-8 semanas após a injeção que o tumor cresce (Figura 3c). Figura 1. Transversal diagrama do olho do rato que destaca as características referenciadas no protocolo. Figura 2. Cultura de células humanas in vitro retinoblastoma fotografada em um 4x), e b) ampliação da objetiva 10x. Retinoblastoma células do tumor primário produzir tumorspheres com uma forma regular esférica e uma membrana externa crisp. Barras de escala representam a) 500 mm, e b) M 200. Figura 3 Eye of RAG2 -. / – Mostrando um rato características) normal, b) leucocoria indicativo de uma massa tumoral na cavidade vítrea, e c) uma grande massa tumoral preenchendo o mundo com distensão periocular associados, hemorragia intra-ocular.