在免疫缺陷小鼠的建立和传播人类视网膜母细胞瘤肿瘤

1。视网膜母细胞瘤tumorspheres的制备视网膜母细胞瘤肿瘤样本下取得的IRB批准的协议。 准备好新鲜的干细胞媒体（Neurobasal的一个媒体，1X的B – 27补充零下20毫微克/毫升表皮生长因子，维生素A，1X非必需氨基酸溶液，1X L -谷氨酰胺，10纳克/毫升碱性成纤维细胞生长因子）。 在一个无菌，组织使用手术刀文化的跨领域技术处理的6孔板，机械分解的肿瘤组织。立即加入100μL定义的干细胞媒体组织和肉末组织使用的手术刀轻轻蔓延。添加5毫升的定义干细胞媒体向好。 在37℃，5％的CO 2在培养箱，每天检查。有些tumorspheres应该从中断的肿瘤组织几乎立即出现超过2-4天的过程中越来越多。 每周5分钟，离心tumorspheres 300xg，悬浮在新鲜配制的干细胞媒体，和吸管达10倍，破坏较大，中央坏死领域，并允许新的，健康的领域，形成。 2。注射肿瘤细胞的制备如果培养tumorspheres，轻轻吸管领域注入15 m​​L锥形管。轻轻吸管向上和向下与血清吸管扰乱领域的10-15倍。 细胞被注入到一个新的管使用一个hemacytometer，等分至少50,000元注射细胞计数。准备尽可能多的基础上可用的细胞数量的注射。 在300xg离心5分钟。仔细吸出上清液于5 mL PBS重悬。重复离心和愿望，并在每次注射10μL的PBS重悬。 3。动物的制备使用胰岛素注射器，管理的啮齿类动物麻醉鸡尾酒的腹腔注射（氯胺酮37.6毫克/毫升，甲苯噻嗪1.92毫克/毫升，acepromazine 0.38毫克/毫升），每克体重1μL（GBW）。等待5分钟的动物成为镇静剂。检查心跳和一个加热垫放在动物。保持在所有时间，直到恢复加热垫的动物。 镇静后，管理1右眼丙美卡因盐酸下降。更换加热垫的动物，并等待1分钟。 管理福林盐酸右眼1滴。更换加热垫的动物，并等待5分钟。如果未发生瞳孔扩张，重管理的1滴，等待5分钟。 监视运动或抽搐的迹象，这可能发生在30分钟后镇静，动物。在运动的最初迹象，管理1μL/ GBW盐酸氯胺酮（10毫克/毫升的PBS稀释），并等待5分钟。 4。注射肿瘤细胞动物麻醉后，置于显微镜下，在其一侧与眼睛朝上的权利和头搁在纱布和中心，以获得红光反射的右眼眼底（瞳孔应该在这个时候扩张），当通过显微镜观察。 撑起轻轻推，同时用两个手指在眼皮上和程序的其余部分持有这一立场稳步全球。 使用连接到鲁尔锁注射器，无菌30号针头刺破全球横向通过结膜和巩膜玻璃体领域的角膜缘相邻（图1）​​，并通过入玻璃体腔脉络膜。从开放中取出针。 汉密尔顿针用酒精棉签消毒。汉密尔顿注射器将细胞悬液，并绘制成针插入开幕，直到针头是通过在玻璃体视网膜附近的镜头背后的显微镜观察。第二而针稳定在这个位置上的人的帮助下，慢慢地压低柱塞。取出的针。如果有必要，用棉签从开放中吸收任何液体。 轻轻松开眼睑的压力，关闭鼠标眼睑。 管理的羟丙甲纤维素的1下降到每只眼睛和返回动物恢复加热垫。 5。监测小鼠体内肿瘤的收获日报，研究注入了白瞳眼（白乳头状反射）和/或眼周，腹胀，通常2-4周注射后变得明显。 一旦检测到肿瘤的生长，安乐死的动物根据机构指引。 如果眼睛和肿瘤眼睑覆盖，使用的手术刀，使睑裂正交的两个切口，并解除皮瓣。 使用可视化立体显微镜下，在角膜缘圆周的切口，去除角膜和晶状体，并认真剖析其他组织使用彧大部分的肿块zers。放置在无菌的RPMI – 1640媒体肿瘤。 使用镊子，从插座上慢慢拉开放全球。为了确保一个附加的视神经，使肿瘤的侵袭，可以可视化，全球拉，直到神经暴露，并用剪刀切断神经，尽可能长时间。放置在10％福尔马林作病理检查的常规处理。 6。代表结果： 视网膜母细胞瘤tumorspheres将开始从分类组织几乎会立即出现，因为它们是从肿块中解放出来。在2-4天之内，更多的tumorspheres将开始形成，并会增加大小。的领域往往是经常的，表现出一个明确的，二次膜周围聚集（图2）。 动物通常呈现4个星期内注射后（图3b），其次是扩大全球和腹胀注射5-8周后，对周围组织，随着肿瘤的增长与白瞳（图3c）。 图1。横断面图鼠标的眼睛突出在协议中所引用的功能。 图2。文化在体外培养的人视网膜母细胞瘤细 ​​胞成像）4X，和b）的10倍的目标放 ​​大倍率。视网膜母细胞瘤的原发肿瘤细胞产生一个普通的球体造型和清脆的外膜tumorspheres。比例尺代表）500微米， 和b）200微米。 白瞳在玻璃体腔内的肿块，C）一个大肿块 。RAG2 眼图 3 – / -小鼠显示一 ）正常功能，B）全球填补相关的眼周腹胀，眼内出血。