Studiare le basi neurali del comportamento adattivo Locomotore in Insetti

1. Il piano di calpestio Il piano di calpestio nero è composto da due lastre di ottone nichelato rivestito permanentemente uniti fianco a fianco ed elettricamente isolate l'una dall'altra da una fascia larga due millimetri di 2-componente colla epossidica (UHU plus, UHU GmbH, Germania), direttamente sotto l'asse longitudinale del l'animale. Essi producono una superficie totale di 13.5×15.5cm (Figura 1). La separazione dei semipiani per le gambe a destra ea sinistra permette indipendente di monitoraggio tarsale contatto per una sola gamba su ogni lato. La piastra è lubrificato con glicerina acqua / miscela con un rapporto di 95 parti di glicerina a 5 parti-soluzione satura di NaCl per trasmettere scivolosità e conducibilità elettrica, la viscosità è di circa 430cStokes (Shankar e Kumar, 1994). La miscela viene applicata direttamente sulla superficie e si disperde con un pezzo di tessuto molle per garantire uno spessore complessivo di 0.1-0.2mm. 2. Stimolazione installazione ottica Episodi piedi sono suscitato utilizzando due proiettori come descritto da Scharstein (1989) per proiettare un modello a strisce su due rotonde, schermi di vetro smerigliato (diametro 130mm, schermi Marata, Linos Photonics, Göttingen, Germania) che sono posizionati ad una distanza di ca. 70 millimetri dagli occhi, e con un angolo di 45 ° nella parte anteriore sinistra e destra del piatto (Fig.1). La lunghezza d'onda del pattern a strisce viene mantenuta costante a λ = 21 °. La frequenza di contrasto degli stimoli in movimento può essere variata tra 0,35, 0,72, 1,07 e 1.49Hz. Dal momento che la reazione degli animali dipende solo dalla frequenza ω contrasto / λ (ω = velocità angolare, λ = lunghezza d'onda modello) se il contrasto modello è sufficientemente elevato (Fermi e Reichhardt, 1963), non abbiamo λ variare nel corso degli esperimenti . La luminanza delle strisce luminose sulla parte dell'animale è di circa 15cd/m2 e il contrasto 0.8. L'occhio composto di insetto stecco (Carausio morosus) ha 24 ommatidi nel dorso-ventrale asse (Friza, 1928) e alcuni più in asse rostro-caudale. Come l'angolo di divergenza degli occhi insetto stecco è in media di 6,2 ° (Jander e Volk-Henrichs, 1970) il nostro modello di lunghezza d'onda è stata di circa 4 volte l'angolo del ommatidi. Gli esperimenti sono installati in una gabbia di Faraday oscurato e si esibisce in una stanza buia a 20-22 ° C. In avanti a piedi è indotto da un andamento progressivo su entrambi gli schermi, dove le strisce ogni mossa schermo verso l'esterno, o un singolo fascio nero su sfondo bianco posto tra le schermate Svolta è indotto da bande in movimento nella stessa direzione su entrambi gli schermi. Non abbiamo trovato una correlazione tra la velocità delle strisce in movimento e l'angolo del turno. Una volta luminanza del pattern a strisce è impostato per indurre a piedi, di solito non richiede ulteriori regolazioni, ma può essere regolata per animali diversi a seconda delle necessità per la tensione delle lampade alogene nei proiettori. 3. Preparazione del Animal Sperimentale Femmina insetti stecco adulti (Carausio morosus) sono incollate (cemento dentale, ProTempII, 3M ESPE, Seefeld, Germania) lato ventrale giù su un bastoncino di balsa (3x5x100mm, LxAxP), che è inserito in un tubo di ottone che ha connettori multipli. L'animale viene tenuto premuto per circa un minuto fino a quando la colla è almeno in parte indurito. La testa e le gambe sporgono dalla parte anteriore e laterale del tassello per permettere la loro libera circolazione. L'area del coxae di tutte le gambe, così come la maggior parte del ventre deve essere lasciato libero di colla. Testa dell'insetto, torace, e le estremità distali di ciascun femore e tibia sono contrassegnati con pigmenti fluorescenti (Dr. Kremer Farbmühle, Aichstetten, Germania) miscelato con cemento dentale per il monitoraggio video di seguito. 4. Posizionamento di elettrodi EMG L'attività muscolare dei muscoli delle gambe diversi come, in questo esempio, il goniometro e muscoli coxae retrattore, che si trovano nel torace e la protrazione causa (movimento in avanti) e retrazione (movimento all'indietro) della gamba, viene registrata per mezzo di elettrodi EMG impiantato nel torace. Tutte le registrazioni EMG sono amplificati in modo differenziato. Il segnale è stato amplificato 100 volte in un preamplificatore (elettronica officina, Istituto Zoologico, Colonia), filtro passa-banda (100Hz-2000Hz), ulteriormente amplificata (10x) e importati attraverso un convertitore AD in spike2 (Vers.5.05, CED, Cambridge, UK). Gli elettrodi sono fatti di fili di rame rivestiti (Elektrisola, Eckernhagen, Germania; 47μm diametro esterno). Per un elettrodo, due fili vengono prima spalmata di colla, poi, i due fili appiccicosi sono intrecciati intorno a vicenda Ad una estremità estremità del filo ritorto sono saldati ad un mini-plug. All'altra estremità i fili vengono tagliati per fornire le estremità pulita senza isolamento per l'inserimento nel animale. Gli elettrodi EMG sono Plugged nel connettore piccolo, alla fine del tubo di ottone. Un perno Minuten è usato per perforare forellini nella cuticola Le estremità taglio degli elettrodi vengono poi separati e inserita in un muscolo a distanza di circa 1 millimetro l'uno dall'altro, che, nella nostra esperienza, dà un buon rapporto segnale rumore. Si deve prestare attenzione a non inserire gli elettrodi troppo in profondità nel muscolo in modo da evitare il danno. La figura 2 mostra la posizione degli elettrodi nel torace dell'animale. La Figura 3 mostra un animale con i cavi elettrodo in posizione. Noi usiamo una piccola goccia di colla histoacrylic (3M Vetbond, San Paolo, MN, USA) per tenere i fili in posizione. Un filo di terra viene inserito nell'addome. 5. Registrazione del contatto tarsale Contatto tarsale è sempre registrato insieme con tracce EMG. Poiché la superficie scivolosa è diviso in due metà, un massimo di due contatti controlaterale tarsali possono essere registrati nello stesso momento. A tal fine, la gamba viene utilizzato come un "interruttore" per chiudere un circuito tra la piastra e l'amplificatore. Corrente può essere applicata alle placche separatamente attraverso due prese alla base di ogni piatto. Siamo in grado di generare due segnali ad onda quadra con 2-4mV ampiezze con un generatore di impulsi (modello MS501, elettronica di laboratorio, Istituto Zoologico, Colonia) che sono in ritardo di fase di 90 °. I segnali vengono attenuati da 60dB (/ 1000) e applicato le due metà della superficie scivolosa. In questo esperimento utilizziamo solo uno dei due segnali. E 'allo stesso tempo inserito in un lock-in-amplificatore come un segnale di riferimento. La fase 2-lock-in-amplificatore (elettronica officina, Istituto Zoologico, Colonia) amplifica selettivamente solo segnali della stessa frequenza e fase, come il segnale di riferimento fornito. Un secondo canale rileva solo il 90 ° fase del segnale ritardato. Segnali di rumore a frequenze diverse dalla frequenza di riferimento vengono rifiutate e non influenzano la misura. Il segnale di uscita dell'amplificatore è immessa in un convertitore AD (Micro 1401k II, CED, Cambridge, UK) e digitalizzate Spike2 uso. Tra il touch-down e decollo del tarso sulla e dalla superficie scivolosa, la corrente scorre dalla piastra attraverso tarso e tibia in filo di rame (vedi sotto: 5,3-5,8). L'amplificatore scelto ha una elevata resistenza di ingresso (1M) e la tensione del segnale è molto piccolo in modo da evitare di compromettere il comportamento a piedi dell'animale. Il passaggio di corrente attraverso il tarso e tibia è compreso tra 2 e 4NA. Il lead time del segnale durante il touch-down, tra l'entrata in il lubrificante e la superficie di contatto è inferiore a 1ms. La transizione del segnale di contatto durante il decollo è meno ripida e più ritardata. Ciò è dovuto al ritardato strappo del lubrificante dal tarso da un effetto di risalita capillare e grazie al movimento della gamba, senza completa lift-off in fase dinamica. Il tubo di ottone con il bastone balsa a cui è incollato l'animale viene inserito in un micromanipolatore per consentire la regolazione in altezza dell'animale compresa tra il 7 e 12 mm al di sopra della superficie scivolosa, che corrisponde all'altezza durante il cammino libero. Al fine di misurare il flusso di corrente ogni volta che il tarso insetto della gamba monitorato è a terra, un filo (diametro 47μm) viene tagliata in pezzi lunghi circa 15 cm. L'isolamento di rame viene rimosso dalla combustione di via con l'alcol. Un ciclo è formato con una estremità del filo e scivolò oltre il tarso dell'animale Il ciclo è legato al termine distale della tibia per fornire un buon contatto tra l'animale e filo. Il filo è poi fissato sul torace dell'animale con una goccia di colla bicomponente (ProTempII, vedi sopra), e collegata al amplificatore differenziale tramite un morsetto alligatore. Per migliorare la conducibilità del filo alle estremità, una goccia di crema elettrodo viene applicato (Marquette Hellige, Friburgo, Germania) sulle aree di contatto. La potenza del segnale viene poi testato sul monitor. A causa delle proprietà del filtro passa-basso del lock-in-amplificatore (10ms costante di tempo) e la lift-off/touch-down graduale del tarso, il segnale non è un segnale preciso quadrati. Si deve quindi fare impostare soglie adatto vicino al punto di transizione per determinare l'esatta tempistica di contatto tarsale e controllare manualmente ogni evento determinato dal software di digitalizzazione. Basata sul contatto del tarso, abbiamo definito il momento in cui il tarso di una gamba dato era a terra come posizione e il tempo in cui era nell'aria come fase dinamica. Il segnale di trigger per la fotocamera viene registrato contemporaneamente la traccia EMG e il segnale di contatto del tarso, e permette un preciso quadro di correlazione struttura di comportamento e le tracce registrate. 6. La registrazione ottica di movimenti delle gambe per l'analisi digitale La frequenza di stepping insetti stecco su superfici scivolose può raggiungere i 3-4 Hz (Graham e Cruse, 1981). Prima di registrare sequenze a piedi, uno specchio è posto in un angolo di 45 ° dietro all'animale di avere un monitor aggiuntivo visivo per touch-down. La fotocamera è di indurre dall'esterno e le immagini sono inserite in un PC attraverso una interfaccia FireWire. Registriamo piedi sequenze dall'alto con una telecamera di video ad alta velocità (Marlin F-033C, Allied Vision Technologies, Stadtroda, Germania) a 100 fps per analizzare i movimenti delle gambe digitalmente, e correlare con l'attività EMG e il contatto tarsale. Durante la registrazione di sequenze a piedi, l'animale è illuminato con array di LED blu (30-50V DC, 24cd luminanza, Elettronica Workshop, Istituto Zoologico, Università di Colonia), che sono regolate in intensità per illuminare i marcatori fluorescenti. Secondo la letteratura (Schlegtendal, 1934), insetti stecco non possiedono la visione a colori e non abbiamo osservato un effetto negativo di illuminazione luce UV sulla risposta di svolta. Un filtro giallo davanti all'obiettivo della fotocamera sopprime la breve lunghezza d'onda della luce di attivazione e dà un contrasto maggiore per le registrazioni video. I file video possono essere analizzati utilizzando il software di monitoraggio del movimento (WINanalyze, Vers.1.9, Mikromak servizio, Berlino, Germania). 7. Registrazione di sequenze Walking Come controllo, in primo luogo una sequenza a piedi con un animale intatto è registrato. La velocità del modello a strisce è impostata, e il modello e la registrazione video sono iniziate all'incirca nello stesso momento. Se l'animale non si avvia locomozione spontaneamente, può essere stimolata al ventre con un pennello (Bässler e Wegener, 1983), o da un soffio d'aria per le antenne. In questo caso, gli animali toccato nella parte sinistra dell'addome tendono a girare a sinistra e viceversa. Il modello a strisce è continuato a muoversi fino a quando l'animale smette di camminare o fino a quando dopo 3 minuti di registrazione continua. Al fine di testare fino a che punto l'attività muscolare a una gamba dipende da un input sensoriale dalle gambe vicini, l'animale è indotto a autotomize sue gambe. Il sito di autotomia si chiude in modo naturale in pochi secondi. Un esempio di un animale con frontale autotomized e zampe posteriori è mostrata in Figura 3. Ad esempio, per gli esperimenti con gli animali che hanno una sola gamba centrale, ci induce autotomia delle gambe pro e metathoracic pizzicando il femore prossimale con un paio di pinze (Schmidt e Grund, 2003) o tagliare le gambe a livello del coxae dopo la registrazione dal intatta di un animale. Dopo che un minimo di 30 minuti per tempo di recupero è dato per l'animale. Poi abbiamo il nuovo record sequenze camminare come prima. In preparazione ridotta, spesso abbiamo bisogno di indurre a piedi con pennellate di vernice. 8. Rappresentante dei risultati: Figura 1 configurazione sperimentale; A:. Fotografia di un insetto stecco legato sopra la superficie scivolosa, contrassegnati con pigmenti fluorescenti per il monitoraggio delle gambe e cablato per la registrazione EMG e misura a contatto tarsale. B: schema di collegamento per la registrazione a doppio contatto tarsica della gamba durante la deambulazione sulla superficie scivolosa. Figura 2. Posizioni per il posizionamento di elettrodi EMG nei muscoli goniometro e divaricatore nel torace della gamba centrale bastone di insetti. ML: metà gamba; FL: gamba . Figura 3 Stick insetti con fili EMG nei muscoli pro e retrattore della gamba in posizione centrale, zampe anteriori e posteriori sono stati rimossi per studiare l'effetto della presenza di gambe vicini sulla cinematica e l'attività dei muscoli delle gambe in mezzo la preparazione ridotta. Figura 4. Traccia Esempio di attività retrattore EMG con segnale di riferimento di contatto tarsale in una gamba dentro mezzo durante la tornitura. All'inizio della traccia (la prima blue box), il riavvolgitore è attivo durante l'appoggio, mentre la gamba ha contatto con il terreno ("circuito chiuso"), indicando che la gamba fa passi in avanti, dopo un breve passaggio (seconda scatola blu), il riavvolgitore è attivo durante l'oscillazione, mentre la gamba è in aria ("circuito aperto", il terzo blue box), che mostra la presenza di passi indietro regia. Figura 5. Schermata di una registrazione dal goniometro (traccia in alto) e divaricatore (metà traccia) i muscoli e la traccia simultaneamente contatto registrato tarso (traccia in basso). Nota l'attività di alternanza nelle tracce EMG che corrisponde all'attività dei due muscoli nel ciclo di passo, che è l'attività goniometro appena prima e duranteswing, quando la perdita di contatto tarsale traccia segnali di contatto con il terreno, e l'attività retrattore dopo e durante touch-down del tarso, quando la gamba è in posizione. L'inserto mostra il file video corrispondente corrispondente a questa registrazione che viene utilizzato per verificare il comportamento dell'animale.