Un procedimiento de 1,5 horas para la identificación de Enterococcus Especies directamente los cultivos de sangre

1. Recogida y preparación de Recoger la sangre venosa de pacientes con sospecha de sepsis y poner en dos BACTEC (BD, Sparks, MD) botellas de hemocultivos, una aeróbica y anaeróbica uno, con un total un conjunto de hemocultivo. Botellas lugar en el BACTEC 9240 instrumento a 35 ° C. Incubar hasta que el instrumento se activa la alarma por el crecimiento de organismos en la botella de hemocultivo. Retire la botella del instrumento hemocultivo. 2. Preparación de los reactivos antes de la tinción Prepare la solución de lavado mediante la adición de 4 ml de solución de lavado 60x seguido por 240 ml de agua dulce desionizada o destilada directamente al plato de tinción. Coloque el plato en la tinción de la 55 ° C baño de agua a calentar. Almacenar el concentrado restante a 2-8 º C. Quite el soporte de montaje del refrigerador y la temperatura ambiente. 3. La tinción de Gram Agite suavemente el frasco de cultivo de sangre. Usando una aguja y una jeringa o un aparato de subcultivo, remover la sangre (aproximadamente 5 ml) de la botella y colocar en un tubo estéril tornillo tope. Con una pipeta estéril, coloque una gota grande de sangre sobre un portaobjetos de vidrio. Aire seco de la diapositiva y fijar con metanol durante 10 segundos. Permita que seque al aire libre de diapositivas. Realizar una tinción de Gram del frotis de sangre para determinar la morfología del organismo en crecimiento en la botella de hemocultivo. El uso de un lente de inmersión en aceite, la vista de diapositivas. Cocos gram positivos en pares y cadenas cortas observado en la tinción de Gram es más consistente con especies de Enterococcus. Este resultado tinción de Gram se determina la selección del kit de la sonda adecuada PNA FISH para el uso de la identificación de bacterias. Esta cultura de la sangre se colorean con la E. faecalis / OE PNA FISH mancha. 4. PNA FISH manchas Mezclar el tubo que contiene la sangre suavemente por agitación antes de la preparación de frotis. Coloque una gota de solución de fijación en el bienestar de un portaobjetos de microscopio PNA PESCADO. Transferencia de 10 l, o una pequeña gota del tubo con el hemocultivo positivo a la solución de fijación y mezclar suavemente para emulsionar. Fijar los frotis por calentamiento durante 20 minutos. a 55 ° C en una placa calefactora. 5. La calidad del material de control Uno positivo y otro negativo de diapositivas de control de calidad deben ser probados con cada lote de diapositivas para la tinción. Use E. faecalis / OE Control de diapositivas comprado AdvanDx para este fin o preparar los frotis de cultivos líquidos de cepas de referencia de E. faecalis y E. faecium como control positivo, ya sea en diapositivas independientes o mezclados en una diapositiva y Staphylococcus spp o Streptococcus spp como material de control negativo. Los resultados de control de calidad debe ser capaz de controlar las condiciones de las pruebas adecuadas, en particular los que afectan a la hibridación rigor y la penetración de la pared celular, ya que la metodología PNA está diseñado para optimizar la penetración de la pared celular 6. Hibridación Añadir una gota de E. faecalis / OE a la Autoridad Nacional Palestina y en el portaobjetos con la extensión. Añadir cubreobjetos. Evite las burbujas de aire. Incubar durante 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C en la placa de calefacción Después de la incubación a cabo las diapositivas en soporte de diapositivas 7. Lávese las estrictas Soporte de diapositivas sumergirse en la solución de lavado precalentado a 55 ° C y retirar con cuidado el cubreobjetos. A menudo, los cubreobjetos se desliza suavemente agitando el portaobjetos en la solución de lavado. En ocasiones, los cubreobjetos se empujan suavemente con unas pinzas. Incubar en la solución de lavado durante 30 ± 5 min. a 55 ± 1 ° C. Eliminar las diapositivas de la solución de lavado Permita que la diapositiva se seque al aire 8. Montaje Añadir una gota de medio de montaje a cada diapositiva Añadir cubreobjetos. Evite las burbujas de aire. Examinar el portaobjetos en un microscopio de fluorescencia en 2 horas. No exponga las transparencias a la luz solar directa u otras fuentes de luz intensa, ya que puede conducir a la extinción de fluorescencia. 9. Interpretación de los resultados El microscopio de fluorescencia para el examen de diapositivas debe estar equipado con el filtro de banda AdvanDx doble y un objetivo de aceite de 60x o 100x. Las diapositivas de control de calidad deben examinarse en primer lugar para confirmar que la hibridación se produjo. E. faecalis debe aparecer como de color verde brillante fluorescente cocos en múltiples campos de la vista y el E. faecium aparecerá como cocos brillantes de color rojo. No enterococos portaobjetos de control debe aparecer no fluorescentes. Después de confirmar que el sistema en los controles, las diapositivas de los pacientes pueden ser examinados. En un primer momento la sangre film se adopta tonos rojizos, pero las de color rojo brillante y los cocos verdes será muy evidente. Figura 1. Ejemplos representativos de verde-positivas E. faecalis (izquierda), rojo positivo E. faecium (centro) y negativa (derecha) resultados de la prueba. 10. Resultados representante Tres instituciones se incluyeron en un ensayo clínico multicéntrico evaluando este PNA FISH mancha y la comparación de un protocolo de 2.5 horas para el protocolo de hora acortó 1.5 que acaba de ser revisado. Un total de 152 cocos Gram positivos rutina en pares y cadenas (GPC) frascos de hemocultivo positivo se incluyeron en los estudios. Hubo un 100% (152/152) concordancia entre los resultados de la modificación y el procedimiento de ensayo original de E. faecalis / OE PNA FISH: 41/41 E. faecalis, 33/33 otros enterococos y 78/78 GPC otros (Tabla 1). Este método de tinción había exquisita sensibilidad y especificidad en este estudio clínico (tabla 2). Los métodos de rutina E. faecalis / OE PNA FISH procedimiento estándar E. faecalis / OE PNA procedimiento FISH corto E. faecalis 41 41 (verde Positivo) 41 (verde Positivo) E. faecium 27 27 (Rojo Positivo) 27 (Rojo Positivo) E. casseliflavus 2 2 (Rojo Positivo) 2 (Rojo Positivo) E. gallinarum 2 2 (Rojo Positivo) 2 (Rojo Positivo) Otras especies de Enterococcus. 2 2 (Rojo Positivo) 2 (Rojo Positivo) S. pneumoniae 17 17 (Negativa) 17 (Negativa) S. viridans 33 33 (Negativa) 33 (Negativa) S. mitis 1 1 (negativo) 1 (negativo) S. pyogenes 3 3 (negativo) 3 (negativo) S. bovis 2 2 (negativo) 2 (negativo) S. salivarius 1 1 (negativo) 1 (negativo) S. sanguinis 2 2 (negativo) 2 (negativo) S. agalagtae 7 7 (Negativo) 7 (Negativo) Otros Streptococcus spp. 7 7 (Negativo) 7 (Negativo) Abiotrophia spp. 3 3 (negativo) 3 (negativo) Peptostrepococcus spp. 2 2 (negativo) 2 (negativo) Total 152 152/152 100% de acuerdo 152/152 100% de acuerdo Listado de la Tabla 1. Bacterias de prueba utilizando el estándar (2.5hr) y el protocolo rápido (1,5 horas). E.faecalis sensibilidad Sensibilidad de otras especies de Enterococcus. Especificidad 100% (41/41) IC del 95% (93,0 a 100) 100% (33/33) 33/33 IC del 95% (91,3 a 100) 100% (78/78) IC del 95% (96,2 a 100) Tabla 2. Sensibilidad y especificidad del protocolo PESCADO 1,5 horas PNA.