の識別のための1.5時間の手順腸球菌種

1。標本の収集と準備敗血症が疑われる患者から静脈血を採取し、一緒に1つ血液培養のセットを含む二バクテック（BD、スパークス、MD）血液培養ボトル、一つ好気性と嫌気性のいずれかに入れ。 35バクテック9240楽器にボトルを置きます℃を楽器は血液培養ボトル中の生物の成長のためにアラームにトリガされるまでインキュベートする。 血液培養器からボトルを取り外します。 2。染色の前に試薬の調製染色皿に直接新鮮な脱イオン水または蒸留水240 mLを続いて60倍のWash Solutionを4mLを追加することにより、洗浄溶液を準備します。 暖めて55℃の水浴中で染色皿を置く。 2〜8の残りの濃縮液℃に保管してください冷蔵庫から封入剤を取り外し、室温まで昇温。 3。グラム染色優しくスワール血液培養ボトルを。 針と注射器や継代培養装置を用いて、滅菌スクリューキャップ付きチューブのボトルと場所から血液（約5mL）を取り外します。 滅菌ピペットを用いて、ガラスの顕微鏡スライド上に血液中の一つの大きな低下を置きます。 空気は、スライドを乾燥し、10秒間メタノールに修正。 スライドを風乾します。 血液培養ボトルに成長する有機体の形態を決定するために血液のフィルムでグラム染色を行います。 油浸レンズを使用して、スライドを表示します。ペアとグラム染色で観察された短鎖のグラム陽性球菌は、エンテロコッカス種と最も一致している。 このグラム染色の結果は、細菌の同定に使用する適切なPNAのFISHプローブキットの選択を駆動します。この血液培養は、E.を用いて染色されます。 球菌 / OEのPNA FISH染色。 4。 PNAのFISHは、染色塗抹標本の前に渦巻くことにより穏やかに血液を含むチューブを混ぜる。 PNAのFISHの顕微鏡用スライドのよく上の固定液の一滴を置きます。 10μLまたは固定液に血液培養が陽性とチューブから一つの小さなドロップを転送して乳化するために静かに混ぜる。 20分のためにそれらを加熱することにより、スメアを修正。 55 ° Cの加熱プレート上に。 5。品質管理材料つの正と負の品質管理のスライドは、染色用スライドの各バッチでテストする必要があります。 E.を使用してください球菌 / OEコントロールのスライドは、この目的のためにAdvanDxから購入またはE.の参照株の液体培養から塗抹標本を準備するポジティブコントロールは別のスライド上で、または1つのスライドおよび陰性対照物質としてブドウ球菌属やストレプトコッカス属の混合のいずれかとしてfaecalisのとE.フェシウム。 PNAの方法論は、細胞壁の浸透を最適化するように設計されているので、QC結果は、特に適切な試験条件、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと細胞壁の浸透に影響を及ぼすものを監視することができるはずです 6。交配 E.の一滴を追加塗抹標本による顕微鏡スライド上のウェルにフェカリス / OE PNA。 カバースリップを追加。空気の泡を避けてください。 30秒間インキュベートする± 5分。 55℃± 1℃の加熱プレート上にインキュベーション後、スライドキャリアにスライドを配置する 7。厳しいウォッシュ 55℃予熱洗浄液に浸し、スライドキャリア° Cと慎重にカバースリップを削除する。多くの場合、カバースリップは優しく洗浄ソリューションでスライドを撹拌することによりオフスライド。時折、カバースリップを静かにピンセットでオフプッシュする必要があります。 30の洗浄液± 5分でインキュベートする。 55℃± 1℃ 洗浄液からスライドを削除する空気乾燥したスライドを許可する 8。取り付け各スライドに封入剤の一滴を追加カバースリップを追加。空気の泡を避けてください。 2時間以内に蛍光顕微鏡でスライドを調べます。 これは蛍光消光につながる可能性があるので太陽の光などの強い光源を指示するためにスライドを公開しないでください。 9。結果の解釈スライドの検討に用いる蛍光顕微鏡はAdvanDxデュアルバンドフィルタと60倍または100X油浸対物装備されている必要があります。 QCのスライドは、そのハイブリダイゼーションが起こるか確認するために最初に調べる必要があります。E.は球菌は、ビューの複数のフィールドに明るい緑色の蛍光球菌のように表示されますとE.フェシウムは鮮やかな赤色球菌として表示されます。非腸球菌コントロールのスライドは非蛍光表示されます。コントロールにシステムを確認した後、患者のスライドを調べることができます。血液FIL最初はmは、赤みがかった表示されますが、明るい赤と緑球菌は非常に明らかであろう。 図1。緑色の陽性E.の代表的な例としては、 球菌 （左）、赤のプラスE.フェシウム（真ん中）、そして負（右）のテスト結果。 10。代表的な結果三機関は、このPNAのFISH染色を評価し、ちょうど検討された短縮1.5時間のプロトコルに2.5時間のプロトコルを比較する多施設共同臨床試験に含まれていた。ペアとチェーンの152ルーチンのグラム陽性球菌の合計（GPC）陽性の血液培養ボトルは、研究に含まれていた。 100％（152分の152）は、E.のための修正と、元のアッセイ手順の結果の間に合意があった球菌 / OEのPNA FISH：41分の41 E.球菌 、33分の33、他の腸球菌と78分の78他のGPC（表1）。この染色法は、この臨床試験（表2）の間に絶妙な感度と特異性を持っていた。 ルーチン方法 E. faecalisの / OEのPNA FISHの標準手順 E. faecalisの / OEのPNA FISHショート手順 E. faecalisの 41 41（グリーン正） 41（グリーン正） E.フェシウム 27 27（ポジティブレッド） 27（ポジティブレッド） E. casseliflavus 2 2（正レッド） 2（正レッド） E. gallinarum 2 2（正レッド） 2（正レッド） 他の腸球菌属。 2 2（正レッド） 2（正レッド） 肺炎球菌 17 17（負） 17（負） S.ビリダンス 33 33（負） 33（負） S.可鍛鋳鉄 1 1（負） 1（負） S.化膿連鎖 3 3（負） 3（負） S.ボビス 2 2（負） 2（負） S.バリウス 1 1（負） 1（負） S. sanguinis 2 2（負） 2（負） S. agalagtae 7 7（負） 7（負） 他のレンサ球菌属。 7 7（負） 7（負） Abiotrophia属。 3 3（負） 3（負） Peptostrepococcus属。 2 2（負） 2（負） 合計 152 152分の152 100％の契約 152分の152 100％の契約細菌の表1。リストは、標準（2.5時間）と急速に（1.5時間）プロトコルの両方を使用してテスト。 感度E.faecalis 感度その他のエンテロコッカス属。 特異 100％（41分の41） 95％CI（93.0〜100） 100％（33分の33）33分の33 95％CI（91.3〜100） 100％（78分の78） 95％CI（96.2〜100） 表2。1.5時間のPNA FISHプロトコルの感度と特異性。