DNA Mikroarray'ler: Örnek Kalite Kontrol, Dizi Hibridizasyon ve Tarama

1. 2100 Bioanalyzer RNA örnek kalite kontrol analizleri Başlamadan önce, 10 dakika süreyle 70 ° C, merdiven ve örnekleri denatüre. Hemen buz üzerinde soğutun. RNaseZAP RNaz içermeyen su ile 1 dakika 10 sn ile araç elektrotlar, temizleyiniz. Elektrotlar kurumaya izin verin. Kiti ile sağlanan bir spin filtresinin içine jel matriks 550 ul pipeting jel matris hazırlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.500 RCF santrifüjleyin. Kısım için 65, 4 ul alikotları ve mağaza ° C 1 aya kadar jel süzülür. Çip emişli istasyonu hazırlamak için, 1 ml şırınga klip ve luer kilit adaptörü içine yerleştirin. Taban plakası, taban altında vida gevşeme, plaka kaldırma ve vida retightening C konumuna ayarlayın. En üst konumda şırınga klibi ayarlayın. Oda sıcaklığına kadar boya konsantre dengelenmesi. 10 sn vorteksleyin. Süzülmüş jel 65 ul kısım boya 1 ul ekleyin. Vortex ve oda sıcaklığında 10 dakika 13.000 RCF santrifüj. Bir gün içinde kullanın. Numunelerinin çalışılabilmesi için hazır olduğunuzda, Emişli istasyonunda bir çip yerleştirin. Bu protokolde, RNA 6000 nano yongaları kullanıyor. Jel yüklemek için, Pipet 9 ul de siyah bir arka plana karşı beyaz bir "G" ile işaretlenmiş jel boya karışımı. Ucu çok iyi altındaki yerleştiğinden emin olun. 1 ml şırınga pistonu yerleştirin. Emişli istasyonu kapatın. Tıklatın kilitleri emin olun. Klip tarafından düzenlenen kadar yavaş fakat istikrarlı bir pistonu aşağı doğru bastırın. 30 saniye bekleyin. Klibi bırakın. Piston kendisi kadar gidelim. Hareket durduktan sonra, birkaç saniye bekleyin ve 1 ml konumuna pistonu geri çekin. Emişli istasyonu açın. "G" işaretli 2 kuyuların her jel boya karışımı Pipet 9 ul. Pipet 5, 12 örnek kuyuların her ve iyi merdiveni marker ul. Hazırlanan merdiven merdiven Pipet 1 ul. Pipet 1 ul örnek kuyu içine her bir örnek. Pipet 1 de her kullanılmayan örnek marker ul. Vorteks 2,400 rpm'de 1 dakika için çip. Çalıştırmak için çip 2100 Uzman Yazılım başlayın. Çip yerleştirin ve kapağını kapatın. Cihaz on-line ise, bir simge, kapağı açık ya da kapalı ve ne tür çip takılı olmadığını gösterecektir. Doğru bağlantı noktasının seçili olduğundan emin olun. 5 dakika içinde buharlaşmasını önlemek için numunelerin yükleme testinin çalıştırın. 2. Amplifikasyonu ve etiketleme Mikroarray analizi için hazırlamak için, RNA örnekleri T7 RNA polimeraz 3 dayanan bir tepki, genellikle amplifiye ve etiketlenir. Çift ters transkripsiyon tarafından oluşturulan cDNA mahsur. in vitro transkripsiyon reaksiyonu bir cDNA Crna olarak bilinir oluşturmak için kullanılır. Bu reaksiyon dizisi hibridizasyon için etiketli RNA mikrogram miktarlarda üreten etiketli ribonucleotides varlığı yapılır. Amplifikasyon / etiketleme yöntemleri tercih kullanılacak sonraki mikroarray platformu bağlıdır. Bu bölümde, Agilent Hızlı Amp etiketleme kiti kullanılarak floresan etiketli RNA üretimi açıklar. Pipet 50 ng 1.5 ml tüp RNA 5 mg. Hacmi 8.3 ul geçmemelidir. Gerekirse, vakum santrifüj veya alkol ile yağış RNA örnek konsantre. 1.2 T7 astar ul ekleyin. 11.5 ul RNaz içermeyen su ile son hacim kazandırın. RNA denatüre 65 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edin. Biz tüp üst yoğuşmayı önlemek için sıcak bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. 10 dakika inkübasyon sıcak, 5X İlk Strand Tampon sırasında 80 ° C 5 dk. Vortex ve aşağı doğru döndürün. Kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında tutun. 10 dakika inkübasyondan sonra, hızlı bir şekilde buz üzerinde denatüre RNA örnekleri soğumasını. CDNA ana karışımı hazırlayın. Reaksiyon başına, aşağıdakileri ekleyin: 4 ul 5X İlk Strand Tampon 2 ul 0.1 M DTT 1 ul 10 mM dNTP 1 ul MMLV-RT enzimi 0.5 ul RNaz Out. Bileşenlerin tersine tüp 4 kez karıştırın. Girdap değil. Tüpün dibinde içeriğini toplamak için aşağı spin. Örnek başına 8.5 ul ana karışımı ekleyin. Yukarı ve aşağı pipeting karıştırın. 2 saat boyunca inkübe 40 ° C, 10 dakika 65 ° C Isıtılmış bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. Tüpler 5 dakika buz aktarın. Transkripsiyon ana karışımı hazırlayın. Reaksiyon başına, aşağıdakileri ekleyin: 15.3 ul nükleaz ücretsiz su 20 ul4X transkripsiyon tamponu 6 ul 0.1 M DTT 8 ul UTP'larının 6.4 ul% 50 PEG (PEG 40 ° C prewarmed ve tabanda sağlamak için vortekslenmiş olmalıdır) 0.5 ul RNaz Out 0.6 ul inorganik pyrophosphatase 0.8 ul T7 RNA polimeraz 2.4 ul Cy3 veya Cy5 CTP Kısaca örnekler tüpün dibinde içeriğini toplamak için dönerler. Transkripsiyon Master Mix örnek başına 60 ul ekleyin. 2 saat 40 ° C'de inkübe edin. 20 ul RNaz ücretsiz su ekleyin. Tüzel kişiliği olmayan nükleotidlerin kaldırmak için etiketli Crna arındırın. Biz Qiagen Kullanıcı RNeasy Mini sütunları kullanmanızı öneririz. Sayısal olarak etiketlenir Crna. Biz Mikroarray Ölçüm modunda bir NanoDrop2000 spektrofotometre kullanmanızı öneririz. Örnek türü olarak RNA-40 seçin emin olun. Kayıt örnek konsantrasyonu, verim (ses ile çarpılır konsantrasyon olarak hesaplanmıştır) ve spesifik aktivite (Crna konsantrasyonu üzerindeki boya konsantrasyonu rasyon ile çarpılarak 1000 olarak hesaplanmıştır). Mikroarray hibridizasyon için, en az 825 ng ve en az 8 pmol / mg belirli bir faaliyet bir verim elde etmek için gereklidir. 3. Mikroarray hibridizasyon Hibridizasyon istasyonu ve set açın 65 ° C'de en az 2 saat önce hibridizasyon başlar. Hibridizasyon örneği hazırlamak için, 1.5 ml tüp aşağıdaki karışımı: 825 ng Cy3 Crna (bu genellikle "tedavi" örnek) 825 ng Cy5 Crna (bu genellikle "referans" örnek) 11 ul 10X Engelleme ajan. Son bir hacim 52.8 ul RNaz ücretsiz su ekleyin 2.2 ul parçalanma tampon ekleyin. Karıştırmak için düşük hızda karıştırın. 60 ° C'de tam 30 dakika boyunca inkübe. Bu dizi hibridizasyon etiketli parçaları oluşturur Crna parçalanma adımdır. Tam olarak tarif inkübe için çok önemlidir. Biz ısıtmalı bir kapak ile bir termalcycler kullanmanızı öneririz. Bu tam olarak doğru ortalama uzunluğu probları oluşturmak için açıklanan inkübe için çok önemlidir. Aşırı veya yetersiz parçalanma, yanlış negatif veya yanlış pozitif sonuçlanacaktır. Parçalanma durdurmak için 55 ul 2X Hibridizasyon tamponu ekleyin. Pipetleme kabarcıkları tanıtmak için özel bir özen karıştırın. Tüpün dibinde içerik toplamak için maksimum hızda 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Kabarcıkları gözlenmesi halinde, bunları kaldırmak için uzun santrifüjlenir. Tüp, ışıktan korumalı buz koyun. Mümkün olduğunca çabuk dizi örnek yükleyin. Dizi yüklemek için, ilk melezleme odası hazırlamak. Bu protokol ile Agilent 4x44K dizileri Roche-NimbleGen melezleme sistemi ve A4 mikser odaları kullanımı anlatılmaktadır. Ilk montaj / sökme aracı, barkod tarafında bir mikroarray slayt yerleştirin. Bir A4 mikseri açın ve yapıştırıcı maruz. Dizi ve herhangi bir hareketi önlemek için montaj / sökme aracı Holding ucunda başlayarak, slayt A4 mikseri. Bu aracı doğru hizalandığından emin olun. Mikser, tüm dizi slayt boyunca sopa. Slayt / karıştırıcı montaj kaldırmak için mikser ucundan çekin. Anırma aracını kullanarak, sıkı theslide yapıştırılmış emin olmak için yapışkanlı conta boyunca tüm basın. Yapıştırıcı ve slayt arasında sıkışıp kalmış küçük hava kabarcıkları karanlık bir arka plana karşı görülebilir. Anırma aracı ile bu kabarcıklarını çıkarmak için fazladan zaman ayırın. Dizi şimdi yüklenecek hazırdır. Hibridizasyon örnek 100 ul yüklemek için pozitif deplasmanlı pipet kullanın. Ucu liman deliğin içinde sıkıca bastırın; sonra hava dizi alanda sıkışıp olmadığını, yavaş ve yumuşak bir şekilde dağıtmak. Geri örnek emmek için deneyin. Tüm örnek reçete edildikten sonra, piston bırakmadan liman delik ucundan tutun. Örnek Dizinin tamamını kaplar ve sıvı havalandırma portu çıkmaya başlar, hızlı bir pipet çıkarın. Sadece piston ucu slayttan sonra bırakın. Iki limanlarında yavaşça dab aşırı sıvı. Odanın kendisi örnek çizmezseniz emin olun. Cımbız kullanarak etiketleri ile port delikleri örtün. Hibridizasyon istasyonu slayt koyun ve mesane delikleri O-ring içinde doğru konumda olduğunu kontrol edin. Bu hibridizasyon sırasında karıştırma uygun sağlayacaktır. Slayt kapağı ve istasyon kapağı kapatın. Karıştırma modu B. istasyonu ayarlayın 65 ° C'de 17 saat süreyle dizi melezleşme. Triton X-102% 0.005 'i son bir konsantrasyonu ekleyerek hazırlayın Tampon 2 yıkayın. ° C gecede 37 tutun. 4. Mikroarray yıkama Tampon 1,% 0.005 'i son bir konsantrasyon Wash Triton X-102 ekleyin. Oda sıcaklığı az tutun.e. Hibridizasyon bittiğinde, Yıkama Tampon 1 ile cam tabak "A" doldurun. Çanak montaj / sökme aracı tutun ve bazı manevra de izin vermek için yeterince büyük olmalıdır. Tüm yıkar züccaciye yapılmalıdır. Dizi yüksek bir arka plan ile sonuçlanan leach bileşikler etme eğilimi, plastik tabaklar kaçının. "B" bir leke tabağına bir slayt rafı ve bir heyecan bar koyun. Raf kapsar emin olun, Yıkama tampon 1 ile doldurun. , Oda sıcaklığında bir heyecan plaka üzerine yerleştirin. Bir heyecan bir heyecan plaka üzerinde boş bir leke tabağına "C" ve yer bar koyun. Dizi çıkarın ve montaj / sökme aracı koyun. "A" çanak Batmak tüm montaj. A4 karıştırıcı dikkatlice soyulabilir, bir yandan ters taraftan montaj / sökme aracı ve slayt tutarken. Dizi alanda çizmez emin olun. Tabak boyama "B" rafa slayt hızla yerleştirin. Şu andan itibaren Cy5 boya ozona duyarlı olduğundan, havaya maruz kalma minimize edilmelidir. Bir seferde 8 dizileri fazla yıkamayın. Orta hızda 1 dakika karıştırarak yıkayınız. Önceden ısıtılmış Yıkama tampon 2 ile "C" çanak boyama doldurun. Slaytları transferi ve 1 dakika boyunca yıkayın. Çok yavaş, slayt bıraktığı damlacıklar en aza indirmek için çanak "C" boyama slayt rafa kaldırın. 2 dakika boyunca iplik slayt kurulayın. Uyumlu bir santrifüj mevcut değilse, slayt santrifüj ya da 50 ml konik tüp içinde argon gazı darbe. 50 ml konik tüp slaytlar ve argon gazı ile doldurun. Sinyal kaybını önlemek için hemen tarayın. Moleküler Cihazlar GenePix 4000B tarayıcı kullanmanızı tavsiye ederiz. 5. Temsilcisi Sonuçlar: İyi kalite toplam RNA örnekleri 2 büyük ribozomal RNA türlerinin karşılık, kalite kontrol için Bioanalyzer çalıştırdığınızda sadece iki ana zirve üretmek gerekir. Bazı RNA bozulması, ilk ribozomal RNA zirve öncesinde bir karalama olarak gösterecektir. Ağır bozulmuş 2 ribozomal RNA zirveleri çok düşük yoğunluklu ya da tanımlanabilir olacak iken, düşük kaliteli RNA, geniş bir tepe ya da düşük tutma zaman zirveleri bir dizi gösterecektir. 2100 Bioanalyzer çıkış örnekler için, bakınız şekil 1. Uzman 2100 yazılımı, RNA kalite kantitatif bir ölçüm olarak, bir RNA Bütünlük sayısı, ya da RIN hesaplar. 9 daha yüksek RIN değerleri ile yüksek kaliteli ses örnekleri, mikroarray uygulamalar için en iyi tabii ki. Ancak, makul kalite mikroarray veri üreten 5.2 gibi düşük RIN değerleri örnekleri kullanmıştır. İyi kaliteli diziler, nispeten düşük PMT değerleri yüksek sinyal üretmek gerekir. Yaptığımız denemelerde, transkript çoğu deneysel ve referans örnek benzer seviyelerde mevcut olması bekleniyor; gen ekspresyonu kitlesel, yaygın değişiklikler muhtemelen herhangi bir biyolojik önemi yoksun olacak. Bu nedenle, dizi, yeşil ya da kırmızı yerine daha sarı görünmelidir. İyi kalite sinyalleri de sinyal histogramlar tam örtüşme böyle bir dinamik aralık olmalıdır. Örnekler için, bakınız şekil 2. Şekil 1 insan beyninde tümör dokusundan izole edilen dört RNA örnekleri örneği . RNA 3.1.1 sunulan protokolü kullanılarak izole edilmiştir. Örnek kalite 3.1.3 'te açıklandığı gibi bir RNA 6000 çipi, 2100 Bioanalyzer kullanılarak ölçüldü. Örnekleri 4 farklı RNA nitelikleri temsil etmektedir: A, çok iyi bir RNA kalitesi (RIN> 9), B, kısmen bozulmuş RNA (RIN 5-6, 28S rRNA için önemli ölçüde daha düşük tepe dikkat edin); C, son derece bozulmuş RNA (RIN < 3); D, neredeyse tamamen bozulmuş RNA (RIN = 2). Biz downstream mikroarray uygulamaları için benzer ya da B (RIN> 5.2) daha iyi niteliklere sahip örnekleri başarıyla kullanılmaktadır. Katı ve açık ok uçları, 18S ve 28S rRNA türler sırasıyla konumu, göstermektedir. Şekil 2 dizisi görüntüleri ve dağılım araziler örnekleri. 4X44K Agilent formatında dört dizileri gösteren, tüm slayt önizleme, B, dizi alanlarından biri olan yüksek çözünürlüklü tarama, sinyallerin ne (kırmızı veya yeşil) baskın olduğuna dikkat, C, görüntü scatter plot B sinyalleri tamamen örtüşen ve artık daha 1×10 -6 özellikleri doyurarak yoğunlukta olduğunu unutmayın.