Die Trennung Beads und Zellen in Multi-Kanal-Mikrofluidiksysteme Mit Dielektrophorese und Laminar Flow

Eine allgemeine Darstellung der Geräte-Setup ist in Abbildung 1A dargestellt. Die PCB-Probe Montage wird in einem Querschnitt schematisch in Abbildung 1B beschrieben. 1. Vorbereitung PCB-Elektroden: Design-PCB-Elektroden, um die gewünschte Geometrie zu einer ungleichmäßigen elektrischen Feld zu erzeugen. Customized PCB Elektrode Chips können durch kommerzielle Fertigungseinrichtungen (Abbildung 1C) bestellt werden. Bereiten Sie vorgefertigte Platine Elektroden durch Löten 16-Gauge-Kabel an das Ende jeder gedruckten Metallelektrode (Abb. 1D). Legen Sie den Draht auf das Ende der Elektrode. Halten Sie den Draht in Platz auf dem Metall-Bereich der PCB mit dem heißen Lötkolben den Draht erhitzen. Füttern Sie eine kleine Menge von Lot in den erhitzten Draht um den Draht mit Lot füllen. Nachdem der Draht mit Lötzinn gefüllt ist, entfernen Sie den Lötkolben und hält den Draht am Platz, während das Lot abkühlt. Wiederholen Sie den Lötprozess für jede elektrische Verbindung auf der Platine (Abbildung 1D). 2. Bereiten Mikrofluidikkanälen: Polydimethylsiloxan (PDMS)-basierten mikrofluidischen Kanälen werden unter Verwendung der PDMS-Elastomer, Sylgard 184 von Dow Corning. Ein Master-Form, die die Kanäle definiert ist in der Regel über Standard-Mikrofabrikation Prozesse mit einem Silizium-Wafer und SU-8 Fotolack erzeugt. Mix Basiscompound zu Härter in einem Verhältnis von 10:1 für 5 Minuten. Gießen Sie die Flüssigkeit PDMS auf den vorgefertigten SU-8 Master-Form, und entfernen Sie Luftblasen indem flüssige PDMS für ein paar Minuten Vakuum. Wiederholen Sie die Vakuum-Verfahren bei Bedarf vollständig zu entfernen alle Blasen. Cure die PDMS bei 70 ° C für 2 Stunden. Entfernen PDMS-Stempel mit mikrofluidischen Kanälen aus dem Wafer mit einer Rasierklinge, vorsichtig zu Wafer brechen. Lochung für die Einführung von Flüssigkeiten und Zellen in den mikrofluidischen Gerät. (Hinweis: Spritze Pumpen, Schwerkraft oder Oberflächenspannung Basis fließen kann alle mit DEP verwendet werden.) Überprüfen Sie die Mikrofluidikvorrichtung zu gewährleisten, ist es frei von Staub und Schmutz. Reinigung des PDMS kann leicht erreicht werden mit 3M Scotch Magic Tape. Plasma Bindung der PDMS mikrofluidischen Kanälen, um eine saubere Nr.0 Dicke (80-130 um) Deckglas. Erhitzen Sie das Deckglas-mikrofluidischen Montage bei 100 ° C für mindestens 15 min. 3. Bereiten Sie Medien mit geringerer Leitfähigkeit: Medien mit geringerer Leitfähigkeit wird durch Mischen von 8,5% Sucrose + 0,3% Glukose (w / v) in deionisiertem Wasser (DI). 1 Hinweis:. Wir haben bereits gezeigt, dass Zellen für Tage in konventionellen Zellkulturmedien kultiviert werden können, nachdem sie auf niedrige Leitfähigkeit für kurze Zeit (ca. 30 min) ausgesetzt 11 4. Montieren Microfluidic Kanäle auf PCB-Elektroden: Legen Sie eine kleine Menge (ca. 10 l) von Mineralöl auf der Leiterplatte, um engen Kontakt zwischen der Leiterplatte und das Deckglas zu gewährleisten. Hinweis: Ein optionaler Schritt zur Verringerung Elektrode Visualisierung ist die Beschichtung der Oberfläche der Leiterplatte mit einer sehr dünnen Schicht von schwarzen Permanent-Marker oder Farbe. Legen Sie die Deckglas-mikrofluidischen Kanal Montage auf der geölten PCB, mit Deckglas bildet Kontakt mit dem Öl (Deckglas nach unten). Drücken Sie das Deckglas-mikrofluidischen Montage auf einen guten Kontakt zu gewährleisten und Luftblasen, die aus der Zelle und Bead-Visualisierung beeinträchtigen können zu minimieren. Ein Beispiel für die fertige Gerät ist in Abbildung 1D gezeigt. 5. Sortieren und Concentrate Beads und Zellen mit DEP: Füllen Sie den mikrofluidischen Kanälen mit DI-Wasser oder Medien mit geringerer Leitfähigkeit, die Plasma-Bonding-Verfahren ermöglicht die einfache Beladung von wässrigen Lösungen in den mikrofluidischen Kanälen vorübergehend machen die normalerweise hydrophoben PDMS-Oberfläche hydrophil. Einführung Zellen und / oder Polystyrol-Kügelchen in den Kanal Reservoir (Abbildung 1C). Hier verwenden wir die menschliche Kolonadenokarzinom (HT-29)-Zellen. Verbinden Sie den Ausgang eines Funktionsgenerators an den Eingang eines AC-Endstufe, dann verbinden Sie den Ausgang des Verstärkers an die Elektrode Drähte. Decken Sie alle elektrischen Leitungen und Oberflächen des Setup mit Isolierband um Benutzer aus der möglichen Exposition gegenüber Schock zu schützen. Eine schematische Darstellung der Geräte-Setup ist in Abbildung 1A dargestellt. Stellen Sie den Funktionsgenerator auf eine Sinus-Ausgang von 1,0-1,5 MHz zu erzeugen. Die Amplitude der Ausgabe sollte für den HF-Leistungsverstärker angepasst werden, um eine Leistung von 80-100V auf die Leiterplatte zu produzieren. Die HF-Leistungsverstärker in dieser Arbeit erfordert eine Eingangsspannung um 220-330 mV. Zur Abtrennung von Zellen und Perlen, muss der Laminar-Flow-Rate-kompatibel sein mit der DEP Kraft auf die Zellen und Perlen in den Hauptkanal (Breite w = 100 pm, Höhe h = 27 um) in die Ziel-Kanäle (Breite w = 100 pm bewegen , Höhe h = 27 um). Achtung: bitte mit Leiterplatten-Hersteller, die m bestimmenaximale Betriebsspannungen zu vermeiden, Themen wie PCB Überhitzung oder Schmelzen. Überprüfen Sie die Geräte-Hersteller die Spezifikationen für die Funktion Generator und Leistungsverstärker Hersteller sicheren Betriebszustand Einstellungen bestimmen. Initiieren Sie DEP zu sortieren Zellen und Perlen. Cells Erfahrung positiv-DEP während Polystyrol-Kügelchen negativ-DEP Erfahrung in einer ungleichmäßigen elektrischen Feldes innerhalb des angegebenen Frequenzen. Dies ermöglicht DEP-Kraft-activated bioactuation und Trennung von Zellen und anderen Partikeln in mikrofluidischen Systemen mit erschwinglichen und wiederverwendbare PCBs als Elektroden. 6. Repräsentative Ergebnisse: Wenn DEP effektiv ist bei Betätigung Zellen oder Partikeln, ist eine robuste Ausrichtung innerhalb ungleichmäßige elektrische Felder für statische Bäder oder langsame Strömungsgeschwindigkeiten beobachtet. Unter den Bedingungen der höheren Strömungsgeschwindigkeiten, hängt die Zelle oder Partikel Verhalten auf die relative Orientierung der axialen Strömung um das elektrische Feld und die Strömungsgeschwindigkeit. Darüber hinaus sind die Zell-und Partikel-Verhalten auch abhängig von der elektrischen Feldstärke und der Grad der Uneinheitlichkeit im elektrischen Feld. Typische Verhaltensweisen von Zellen oder Partikel enthalten "Perlenketten", Radfahren, ins Stocken geraten, oder Drehen. Bedingungen, die Kompromisse oder aufzuheben DEP die Anwesenheit von Salzen oder anderen ionischen Moleküle in der Flüssigkeit, schwache elektrische Feldstärke, übermäßiger Strömungsgeschwindigkeiten, Deckgläser, die zu dick sind, oder leitende Lösungen zwischen dem Deckglas und PCB-Elektroden sind (z. B. eine gesprungene Deckglas induzieren können das Mischen von Wasser und Mineralöl). Hier bei der Verwendung von Nr.0 Dicke Deckgläser (80-130 um) und einem Elektrodenabstand von (231 Mikrometer), wandte die Steigung von dem Quadrat der elektrischen Feldstärke, die HT-29 Zellen und Perlen wird geschätzt, dass zwischen 2 werden -8 bis 6 -8 V 2 / um3. 1 Die DEP Kraft kann durch die Messung der Geschwindigkeit des Teilchens, von DEP in statische Flüssigkeit (Abbildung 2A-B) manipuliert geschätzt werden. Aufgrund der geringen Trägheit der Partikel-und hochviskosen Umgebung von mikrofluidischen Kanal wird die hydrodynamische Widerstandskraft gleich, aber in entgegengesetzter Richtung mit der DEP Kraft. Die durchschnittliche bead Geschwindigkeit in der Medien mit geringerer Leitfähigkeit beträgt 34,5 mu m / s mit DEP Spannung von 93 Vpp und 1,5 MHz. Der hydrodynamische Widerstandskraft kann mit folgender Formel berechnet werden. 1 F ziehen = 6πηRv Die durchschnittliche Viskosität η der Medien mit geringerer Leitfähigkeit bei 20 ° C beträgt 1,27 mPa • s und der Wulst Radius R beträgt 7,5 um. Der hydrodynamische Widerstandskraft für die Polystyrol-Mikrokügelchen wird geschätzt auf 6,19 pN werden. Zur Demonstration der Fähigkeit, Kugeln in mikrofluidischen Kanälen betätigen (Abbildung 2C-F), starteten wir den Fluss der Medien mit geringerer Leitfähigkeit durch den Einsatz von Oberflächenspannung vermittelten fließen. Die durchschnittliche bead Geschwindigkeit im Eingangskanal wurde 1540 um / sec, während die durchschnittliche Geschwindigkeit innerhalb der einzelnen Kanäle bis 565 mu m / sec (Abbildung 2C) reduziert wurde. Durch die Initiierung von DEP wurden die Perlen in den zentralen Kanal und nicht in den Seitenkanal veröffentlicht beibehalten. So unter diesen Bedingungen wurden die DEP Kräfte ausreichen, um die Widerstandskraft der Flüssigkeit in den beiden seitlichen Kanälen zu überwinden. Das gleiche Prinzip wurde auch verwendet, um die Perlen aus dem zentralen cannel auf einer einzigen Seite Kanal umzuleiten durch einfache Änderung der Ausrichtung der Kanäle und der Wulst flow, dass der DEP-Elektroden (Abbildung 2E-F). Durch Anwinkeln der Metallelektrode auf der Seite der einzelnen Einlasskanal, wenn DEP initiiert wurde, wurden die Perlen an der Seite des Kanals geführt, wie die Perlen näherte sich dem Trifurkation Punkt. Dort wurden die DEP Kräfte ausreichen, um die Kügelchen in einem der seitlichen Kanälen, in denen der laminaren Strömung weiter, sie treiben durch den Kanal (Abbildung 2F) zu ziehen. Da Zellen und Polystyrol-Kügelchen deutliche Unterschiede in ihrer Fähigkeit, polarisiert werden und betätigt in ungleichmäßigen elektrischen Felder haben, verwenden wir DEP auf die Fähigkeit, die On-Chip-Trennung von Zellen und Perlen, gleichzeitig durchführen zu demonstrieren. Wir verwendeten das gleiche mikrofluidischen Kanal Struktur und PCB-Elektroden, wie in Abbildung 2E-F konfiguriert, aber führte eine Aussetzung der HT-29 Zellen und Perlen in Medien mit geringerer Leitfähigkeit in den einzelnen Einlasskanal (Abbildung 3). Wenn DEP wird eingeführt, und unter diesen Bedingungen, die HT-29 Zellen wurden in den beiden linken Ausgangskanäle beibehalten, während die Perlen in den einzelnen Ausgangskanal auf der rechten Seite beibehalten wurden. Hier werden die Zellen zeigen eine charakteristische "Perle-Verkettung Verhalten, wie sie in der linken Ausgangskanal gesammelt werden. Gelegentlich wird ein Wulst und Zelle werden gemeinsam, in denen sie zusammen sind, gesammelt oft in der Zelle Ausgangskanäle angeschlossen. Aus diesem Experimental Daten ermitteln wir die Sortierung Rate auf 713 Partikel (Zellen und Beads) pro Minute, oder den Gegenwert von 14.260 Zellen und Beads in 20 Minuten. Die Anzahl der Zellen und Perlen abgerufen relevant und nützlich für die Molekularbiologie, bildgebende, biochemische und Lab-on-a-chip-Anwendungen. Abbildung 1. PCB-basierte DEP von Zellen und Partikeln in mikrofluidischen Kanälen. (A) Die Ausrüstung Setup für DEP-basierten Ansteuerung mit einem Funktionsgenerator beginnt die Frequenz und Amplitude des elektrischen Signals zu definieren, dann einen Leistungsverstärker zur Steigerung der Signalstärke des elektrisches Feld auf der Platine erzeugt. (B) Die Mikrofluidikvorrichtung Montage für die Probenvorbereitung Betätigung besteht aus PDMS mikrofluidischen Kanälen irreversibel zu einem nicht gebunden. 0 Dicke Deckglas (80-130 um) durch Sauerstoff-Plasma, nicht leitenden Medien, um zu baden den Zellen und / oder Perlen. (C) Die PCB-Elektroden verwendet hier bestehen aus zwei Regionen, in denen die Elektroden verzahnt, um eine starke nicht-homogenes elektrisches Feld zu erzeugen. (D) Die fertige Gerät: ein PCB mit einer trifurcated Mikrofluidikvorrichtung auf einem einzigen Deckglas, zeigt Einsatz das ganze Gerät mit Elektrodendrähte. (CD) Für Maßstab, sind PCB-Messungen 8,4 cm (l), 2,1 cm (w), mit 5 mm breiten Elektroden. Abbildung 2. Repräsentative Bilder von Zellen und Perlen in Kanälen vor und während der DEP Betätigung. (A) 15 um fluoreszierende Polystyrolkügelchen in Medien mit geringerer Leitfähigkeit Lösung innerhalb eines PDMS mikrofluidischen Kanal, ohne Laminar-Flow-(Zeit verstrichen, 1,23 sec). (B) Nach DEP Initiation, die Perlen auf die PCB-Elektrode Muster (schwarze Streifen), anstatt zwischen den Elektroden (Zeit verstrichen, 8.18 sec) zu migrieren. (C) Perlen in den gleichen Kanälen unter Laminar-Flow zwischen den drei getrennte Kanäle (Zeit verstrichen, 5,3 sec) unterteilt, und wenn DEP eingeleitet wird (D), die Perlen werden betätigt, um nur fließen in den zentralen Kanal (Zeit verstrichen, 4,3 sec). (E) Durch die Änderung der Ausrichtung der Kanäle zu den PCB-Elektroden können Perlen differentiell in den seitlichen Kanälen (F) mit DEP als den zentralen Kanal wie in (D) gezeigt, gerichtet werden. (EF) Abgelaufene Zeit ist 8.23 ​​sec und 5,16 sec, bzw.. Alle Maßstabsbalken = 100 um. Abbildung 3. Repräsentative Bilder von Zellen und Perlen in Kanälen vor und während der DEP Betätigung. (AB) Vor Beginn der DEP, eine gemischte Lösung von humanen Kolon-Adenokarzinom (HT-29)-Zellen und Perlen-Flow aus einem Kanal auf 3 separate Ausgänge. Der offene Pfeil kennzeichnet die Richtung der laminaren Strömung und Kanäle mit gestrichelten Linien zur Orientierung und Klärung skizziert. (CD), indem DEP, sind Perlen und Zellen selektiv in einzelne Kanäle angesteuert als identifiziert. HT-29-Zellen verlassen den zentralen und linken Kanal, während Perlen Ausfahrt den rechten Kanal. Charakteristisch Perle Verkettung von Perlen und Zellen während der DEP Betätigung beobachtet. (A, C) Differential Interference Contrast Bildgebung von Zellen und Perlen in Mikrokanälen macht die Perlen gut sichtbar. Glow Skala Intensität Bilder (B, D) aus dem gleichen DIC Bilder (A, C) die Verbesserung der Visualisierung von Zellen in den Kanälen. Die reflektierende Metall-Elektroden ((A, C) hellen Streifen und (B, D) gelb und grün) bieten ein markantes Wahrzeichen für die Ausrichtung Mikrokanälen an die Elektroden für eine effektive DEP-basierte Betätigung. Maßstabsbalken = 100 um.