확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

1. 버피 코트에서 PBMCs의 분리 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)는 leukapheresis에서 파생된 건강한 기증자 버피 코트를 샘플에서 Ficoll – Paque에 대한 낙관적인 밀도 원심 분리하여 얻을 수 있습니다. Ficoll – Paque 원심 분리는 사소한 수정 따라 제조 업체의 프로토콜로 이루어집니다. 140 ML (일반 버피의 코팅 량이 40-70 ML합니다)의 최종 볼륨 혈액 은행 버피 코트를 정상 기증자에 PBS를 추가합니다. 레이어 Ficoll – Paque (4 튜브) 15 ML에 버피의 외투 샘플 35 ML. 브레이크없이 20 분 동안 400g의 원심 분리기. Ficoll – Paque에서 PBMCs 복구 : 플라즈마 인터페이스를 Ficoll – Paque의 하단에있는 RBCs을 삭제하지 않습니다. 10 분 400g 각 시간을 centrifuging, PBS로 PBMCs 세 번 씻으십시오. PBMCs는 (제 4) RosetteSep에 의해 격리 수있는이 단계에서 NK 세포 확장 또는 NK 세포에 대한 직접 사용할 수 있습니다 남은 PBMCs는 액화 질소에 10 % DMSO를 포함 FBS에 냉동 수 있습니다. Ficoll을 대기음 두 50 ML의 원심 관에 5 단계에서 RBCs를 수집, PBS (50 ML 표시 추가)로 세 번 씻어, 각 시간 RBC 계층의 맨 위에는 granulocytes를 제​​거 뜨는 감추고 대기음. RBCs는 NK 세포의 RosetteSep  정화 (4 항 참조)에 즉시 사용 또는 4 알서버의 솔루션의 같은 볼륨에 저장할 수 있습니다 ° C 나중에 사용하기 위해 (RBCs 4 주 최대 저장할 수 있습니다.) 2. NK 셀 확장 NK 세포 확장이 PBMCs를 사용하거나 NK 세포를 정화 시작하실 수 있습니다. 확장에 사용 PBMCs의 금액이 세 주 확장의 끝에 원하는 NK 세포의 크기에 따라 다양 수 있습니다 자세한 내용은 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오. (참고 1 참조) 자극 하나 주 영 확장 각 5×10 6 PBMCs, 백작과 100 쥐에서 감마 irradiator를 사용하여 10×10 6 K562 Cl9 mIL21을 비추다. 우편 조사, NK 세포 확장 미디어 (NKEM)에 PBS와 resuspend로 세포를 씻어. 10×10 6 조사 K562 Cl9 T75 플라스크에 NKEM 40 ML에 mIL21 (1시 2분 비율)과 37 인큐베이터에 똑바로 놓으 ° C와 5% CO 2.와 종자 5×10 6 PBMCs 일 3과 5 5 분 400g에 원심 분리하여 세포를 복구하고 신선한 NKEM으로 미디어의 절반을 교체 (전체 미디어 볼륨에 대한 신선한 IL2 추가)과 문화를 계속합니다. 자극이 일 6.25 1 주일 끝에 문화에 세포의 수를 계산합니다. 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 5×10 5 세포를 (참고 2 참조) 제쳐두 restimulated하는 각 5×10 6 셀, 백작과 100 쥐에서 감마 irradiator를 사용하여 5×10 6 K562 Cl9 mIL21을 비추다. (참고 3 참조) 2.5×10 5 총 세포 / ML에서 NKEM의 조사 K562 Cl9 mIL21 (1:1 비율)과 resuspend의 동일한 숫자를 추가합니다. T75 flasks의 종자 세포 (플라스크 당 최대 50 ML)를. 10 12 일 세포의 개수를 계산합니다. (참고 3 참조) 셀 번호를 기반으로 신선한 NKEM로 전체 미디어를 변경합니다. 일 14 확장 2 주의 끝에 문화에 세포의 개수를 계산합니다. 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 5×10 5 세포를 (참고 2 참조) 제쳐두 확장이 PBMCs에서 시작된 경우 NK 세포는 RosetteSep 정화 프로토콜 (제 IV 참조)를 사용하여 확장이 단계에서 정화 수 있습니다. 확장은 자극 3 진행 NK 세포를 정화로부터 시작되었습니다하십시오. 정화는 NK 세포 (8 단계에서와 같이)의 순도를 확인 유동세포계측법에 의해 phenotyping에 대한 별도 5×10 5 세포를 설정하면. 정화 NK 세포의 모든 (참고 4 참조)를 사용하여 자극 3 진행합니다. 자극 3 휴대폰 번호에 따라 NKEM에서 조사 K562 Cl9 mIL21 (1:1 비율) (참고 3 참조) Resuspend NK 세포. 17 19 일 세포의 개수를 계산합니다. (참고 3 참조) 셀 번호를 기반으로 신선한 NKEM와 미디어를 변경합니다. 일 21 확장 세 주 끝에 문화에 세포의 개수를 계산합니다. 전체 NK 세포 phenotyping 항체 패널 유동세포계측법 분석을위한 1×10 6 세포를 (표 1 참조) 복구. 나중에 사용하기 위해 유리병 당 5×10 7 세포의 최대 농도에서 10 % DMSO를 포함 FBS에서 세포를 고정. 3. NK 세포 세포 독성 분석 NKEM의 NK 세포와 씨앗의 유리병, PE하기 전에 하루 해동복구를 허용 세포 독성 분석을 rforming. 하나의 타겟 세포 라인, 6×10 5 NK 세포 3×10 오 대상 세포를 사용하여 각 NK 세포 세포 독성 분석을 위해 (주 5 참조)가 필요합니다. NKEM에 Calcein – AM (재고 1 DMSO에 MG / ML)을 (참고 6 참조) diluting하여 CAM – 미디어를 준비합니다. (주 7 참조) CAM – 미디어 1 ML 10 6 타겟 세포를 Resuspend. 가끔 잡고, 37 ° C에서 1 H에 대한 부화. Resuspend NK의 1×10 6 셀 / ML에서 세포 및 U – 하단의 3 우물 각 NK 세포 현탁액의 200uL을 추가 96 – 웰 플레이트에 해당 to10 : 1 E : 그림 1에 표시된 T 비율. (주 8 참조) "최대"를 제외한 모든 나머지 우물에 완전한 미디어 100uL을 추가합니다. "최대"로 2% 트리톤의 100uL X – 100을 추가합니다. 5 후속 E에 대한 NK 세포의 시리얼 dilutions를 수행합니다 : 세포의 100uL 때마다 전송하여 T 비율은 잘 섞는다. 마지막 우물 (0.3125:1의 T 비율 E)에서 100uL 폐기하십시오. calcein 로딩 1 시간 후, 1200 rpm으로 5 분 centrifuging 두 번 NKEM의 목표 세포를 씻으십시오. (참고 9 참조) 1×10 5 셀 / ML에서 대상 세포와 resuspend를 다시 계산합니다. (1×10 4 / 잘) 각 잘하는 대상 세포 100 μL를 추가합니다. 세포 접촉을 시작 100g 1 분 원심 분리기. 37 품어 ° C, 5 % 4 시간 CO 2. 균일 출시 calcein을 중지하기 위해서는 100 μL pipetter로 pipetting하여 부드럽게 문화를 혼합, 펠릿 세포 5 분 100g에 접시를 스핀 다운하여 거품을 피하기 위해 관리하는 새 접시에 뜨는 100 μL를 전송합니다. 미세 바늘을 사용하여 양식을 수있는 거품 팝. 형광 플레이트 리더 (여기 필터 485 NM, 방사 필터 530 NM)를 사용하여 번호판을 읽어보십시오. 히프 읽기를 권장합니다. X 100. – [/ (시험 자료 – 자연 릴리스) (자발적인 자료 최대 릴리스)] 공식에 따라 특정 용해 비율을 계산 4. RosetteSep하여 NK 세포 정제 50 ML 튜브 (PBMC 100:1 RBC)로, PBMCs 또는 확장 세포의에 RBCs의 100 배 초과를 가져가라. 사용 신선한 RBCs 다음 단계로 바로 진행하거나 RBCs가 알서버의 솔루션에 저장된이라면 1,200 rpm으로 centrifuging, RBCs의 수를 계산하고 (100 배 초과) 2퍼센트 FBS와 세 번 보충 PBS로 RBCs의 양을 적절한 세척하는 경우 십분 때마다. 단계 1.7 또는 PBS 단계에서 2.10에서 확장된 세포에서 PBMCs와 RBCs를 결합 + 2% FBS PBMCs 또는 확장 셀 5×10 7 당 1 ML의 마지막 볼륨. RosetteSep의 1μL PBMCs 또는 확장 셀 1×10 6 회  인간 NK 세포 농축 칵테일을 추가합니다. 잘 믹스하고 5 분마다 혼합 부드러운 20 분 동안 상온에서 알을 품다. 같은 부드럽게 PBS + 2% FBS 믹스의 볼륨과 Ficoll – Paque 상단에 레이어를 추가합니다. PBMC 분리에 대한 설명 Ficoll – Paque 원심 분리의 단계 (제 I)를 반복합니다. 정화 후 복구 NK 세포를 카운트하고 북한 세포 순도 (8 단계)에 대한 유동세포계측법에 의해 phenotpying에 대한 5×105 세포를 따로 설정할 수 있습니다. 5. 노트 참고 1. NK 세포가 PBMCs에서 직접 확장 또는 RosetteSep  정화 NK 세포에서하실 수 있습니다. 우리는 유사한 확장 효율성을 지적했지만 어떤 장기 기증자가 확장 이전 RosetteSep로 어려움 정화의 결과로 매우 낮은 NK 세포 번호가있을 수 있습니다. 참고 2. 우리는 일상적 인 경우에는 3 번 CD에 들어 음수 및 CD16 또는 CD56 양성하는 것과 같은 NK 세포를 열거, 확장하는 동안 phenotyping에 대한 CD56 – FITC, CD16 – PE, 그리고 인 경우에는 3 번 CD – PE – Cy5를 사용합니다. 참고 3. 각 매체 변경하거나 자극에서, 2.5 × 10 5 / ML에 resuspend 세포는 확장의 최고 단계에 ML 당 또는 2 백만 이하 NK / PBMC 휴대폰 번호를 유지합니다. 이것은 영양분의 고갈을 방지하고 최대한의 확장과 생존을 달성하는 데 도움이됩니다. 참고 4. NK 확장 속도 stimulations 1 또는 냉동 수있는 세포의 2 부분의 끝에 기증에 의존하고 있으며, 일부는 실험이 필요에 따라 더욱 확대했습니다. 우리는 나중에 확장을위한 냉동 세포를 사용하여 좋은 성공을 있었다. 참고 5. 우리가 NKEM 및 세포 독성 분석을 설정하기위한 NKEM 4 ML에 resuspended 4×10 5 Calcein – AM 스테인드 대상 세포의 700 uls에 resuspended 7×10 5 NK 세포의 최소를 사용하는 것이 좋습니다 오류를위한 공간을 마련하도록하기 위해서. 경우 대상 세포에게 세포의 높은 볼륨에 (최대 6×10 5-6 ML)을 사용중인 미디어 분지의 크기에 따라 필요할 수 있습니다 시딩위한 멀티채널 피펫을 사용합니다. 또한 권장 NK 세포 숫자는 E에 대해 구체적으로 다음과 같습니다 T 비율이 높은 E를 사용, 프로토콜에 게재 : T 비율이 증가이에 따라 ML 당 NK 세포 숫자 (40:1 E 들어 예 : T 비율 사용 4×10 6 셀 / ML) 6 참고. 우리는 1:500, 1:400의 다음 dilutions를 사용하여 원하는 대상 세포 라인에 대한 예비 Calcein – AM 로딩 적정을 수행하는 것이 좋습니다. 1:300, 1:200 1:100과 최대 및 자발적인 릴리스 사이의 최적의 차이를 달성하기 위해. 참고 7. 대상으로 자기편 세포주를 사용하여, 먼저 비 효소 세포 분리 버퍼를 사용하여 단일 세포 현탁액을 준비합니다. ADCC을 수행하는 경우, CAM – 미디어 대상 세포의 중복 튜브를 준비합니다. 참고 8 ADCC을 수행하는 경우, 10시 1분 E에 대응하는 세 우물에 동일한 NK 세포를 추가합니다. ADCC를위한 T. 추가 기증자에 대한 반복합니다. 추가 대상 세포에 대해 반복합니다. 참고 9. ADCC 실험을 수행하는 경우, calcein 로딩 45 분 후, 대상 세포에 대한 ADCC를 유도하는 특정 항체의 10ug를 추가합니다. 15 분 후에, 1,200 rpm으로 5 분 centrifuging 두 번 완벽한 매체 목표 세포를 씻으십시오. Resuspend 1×10 5 셀 / ML에서 세포 프로토콜의 다음 단계로 진행합니다. 6. 대표 결과 그림 2. 확장이 계획하신대로 수행하면 시작 소재, 1×10 9 10 10 전지 (기증자 의존 다양성)에 전형적인 NK 세포 수율 범위로 5×106 PBMCs를 사용하여, 위에서 설명한. 그림은 북한 세포 배 확장을 보여줍니다 (N = 19) 원래 제품에있는 NK 세포에 비해 (평균 + / – quartile). 그림 3. 확장된 NK 세포는 몇 가지 예외 (CD11b, CD160과 CD244)로 unexpanded 기본 NK 세포에 비해 각종 NK 세포 수용체를 표현한다. 그림 4. 버피 코트에서 PBMCs 복구 의존 기증하고 300×10 800×10 6 6 범위 수 있습니다. PBMCs의 18 % – NK 세포는 2 %를 구성 수 있습니다. 확대 세포의 RosetteSep 정화 들어, 40~70%에서 하루에 순수 NK 세포 14 범위의 회복. 확장 및 정화의 추천 프로토콜에 따라 99 %의 NK 세포 순도가 기대할 수 있습니다. 그림 5. 확장된 NK 세포는 neuroblastoma, AML, osteosarcoma 및 흑색증 (대표 AML 살인은 %가 특정 용해으로 표시)을 포함하여 종양 세포 라인의 범위에 대한 세포 독성을 증명하고있다.