기능 및 구조 분석을위한 Peptidyl - tRNAs를 포함 번역 리보솜의 분리

1. 휴대폰 무료 추출 준비합니다. 펠렛 박테리아 건조 대장균의 두 그램 중순 로그 위상 문화가 버퍼의 절반 리터와 두번 씻어 아르에서 얻은 포함 10 MM 트리스 – 아세테이트, 산도 8.0, 14 MM 마그네슘 아세테이트, 60 MM 칼륨 아세테이트, 50 μg 4 5 분 5,000 X g에서 원심 분리하여 / ML phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) ° C. 세척 후, 세균성 펠렛은 버퍼 A. 40 ML에 resuspended입니다 박테리아 세포는 6,000 PSI 압력을 적용, 프랑스 프레스를 사용하여 방해하고 있습니다. 이 압력은 1 인치 피스톤을 사용하여 600 단위에 해당합니다. 중단 정지 깨끗한 유리관 (50 ML)에서 수집됩니다. 중단 정지는 1 ㎜ dithiotreitol (DTT)의 치료 30 분 30,000 XG에 centrifuged입니다. 원심 분리 절차는 결과 뜨는을 사용하여 반복됩니다. 최종 뜨는은 microtubes로 (1 ML) 적절합니다. 마지막으로, aliquots는 드라이 아이스 – 에탄올 혼합물이나 액체 질소를 이용하여 냉동 있으며, -60에 저장됩니다 ° C 또는 -80 ° C. 2. RF2의 열화 휴대폰 무료 추출물 준비. 단백질 렉틴 세파 로스 4B 슬러리 비즈 4.5 ML 한 시간, 상온에서 회전 바퀴를 사용하여 안티 RF2 방지 혈청 5 ML과 혼합됩니다. 혼합물은 항혈청에서 비즈를 분리 XG 2500에서 centrifuged입니다. 폐기시 뜨는은, 안티 – RF2 항체 (안티 RF2 구슬)이있는이 구슬은 나중에 35 밀리미터를 포함하는 버퍼 B 1 ML에 resuspension로 씻어 아르 트리스 – 아세테이트 산도 7.8, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 30 MM의 암모늄 아세테이트 60 MM 칼륨 글루 탐 산염 및 5 μg / 류펩틴의 proteinase 억제제의 ML. 안티 RF2 구슬을 같은 조건 위 표시를 사용하여 원심 분리하여 버퍼 B에서 분리됩니다. 세척 절차는 두 번 반복됩니다. 셀 – 무료 추출물 중 하나 ML은 4, 회전 바퀴를 사용하여 방지 RF2 구슬 150 μL와 혼합됩니다 ° C, 두 시간. 혼합물은 비즈의 세포없이 추출 분리 10,000 XG에 centrifuged입니다. 뜨는은 안티 RF2 구슬의 또 다른 150 μL로 다시 제거 처리됩니다. 이 절차는 결과 셀 무료 추출 솔루션을 한 번 더 반복됩니다. 마지막 셀 – 무료 추출 솔루션은 microtubes로 (100 μL) 적절합니다. aliquots는 드라이 아이스 – 에탄올 혼합물이나 액체 질소를 이용하여 냉동 있으며, -60에 저장됩니다 ° C 또는 -80 ° C. 3. DNA 템플릿의 준비. 그림 1 각 dNTP의 0.2 micromoles 및 50 U에 표시된 oligodeoxynucleotides 각 0.4 nanomoles와 시퀀스가​​ 번역을 포함하는 플라스미드 템플릿 (그림 1)의 혼합 600 femtomoles에 의해 1 ML PCR 반응을 준비 DNA 형성 촉매 – Stratagene 회사가 제공하는 버퍼에의 DNA 중합 효소는 다음과 조건에서 증폭 반응을 수행 : 94 ° 2 분에 대한 C, (94 ° 30 S에 대한 C, 55 ° 30 S에 대한 C, 72 ° 1 분에 대한 C, 30 주기) 72 ° C 12 분. 10분의 1 3 M의 아세트산 나트륨의 볼륨, 산도 5.2 얼음처럼 차가운 에탄올 2 볼륨을 추가하여 DNA를 precipitating하여 PCR – 제품을 정화. 한 번 더 석출 절차를 반복합니다. 디에틸 – pyrocarbonate (DEPC) 처리 – 물 100 μL의 DNA를 Resuspend. 일반적으로이 절차는 600 BP의 DNA 제품의 100 μg을 산출. 아가로 오스의 젤에 전기 영동하여 PCR 제품의 무결성을 확인합니다. 4. 비오틴 라벨 mRNA의 준비. ATP, CTP, GTP, UTP의 0.3 micromoles, 비오틴 – 16 – UTP 50 nanomoles, 10 μL의 0.5 micromoles와 PCR – 생성된 DNA 조각의 5 μg을 혼합하여 DEPC 처리된 물에 시험 관내 전사 반응에 100 μL 준비 Promega (주)가 제공하는 버퍼에 T7 효소 믹스 37에서 반응 혼합물을 품어 ° C를 3 시간 동안. 얻은 mRNA의 양을 계량하려면 DNA 템플릿은 RNase 무료 DNase를 추가하여 제거하여야한다. 37 반응 ° C 10 분 품어. 3 M의 아세트산 나트륨, 산도 5.2 차가운 에탄올 2 볼륨 10분의 1 볼륨을 추가하여 RNA를 precipitating하여 mRNA 제품을 정화. 한 번 더 석출 절차를 반복합니다. DEPC 처리 – 물 100 μL의 mRNA를 Resuspend. 보통 600 NT 비오틴 1-2 MG 사이에이 절차의 수확량은 mRNA 제품을 분류. 아가로 오스 젤에 전기 영동하여 비오틴 표시 mRNA 제품의 무결성을 확인합니다. 5. Peptidyl – tRNA를 포함 번역 리보솜의 분리. 열아홉 아미노산 각각의 지방산 – 모든 아미노산을 제외한 방사성 아미노산으로 대체됩니다 75 nanomoles와 비오틴 – 레이블 mRNA의 10-15 μg을 혼합하여 DEPC 처리된 물에 체외 번역 반응 혼합물에 500 μL 준비 50 방사성 아미노산 (37MBq)의 μCi, 그리고 20-5 40 MM 트리스 – 아세테이트, 산도 8.0, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 175 MM 칼륨 아세테이트, 10 MM의 암모늄 아세테이트, 2 MM DTT, 2 MM ATP, 0.5를 포함하는 버퍼 반응 혼합물에 RF2 – 고갈 셀 – 무료 추출물, 0 μL MM GTP, 30 MM의 phosphoenolpyruvate (응원), 0.3 U / ML pyruvate의 키나제 (PK), 폴리에틸렌 글리콜 3.5 % 8000 1 ㎜의 spermidine, 20 μg / ML folinic 산성, 250 μg / E.에서 ML tRNA 대장균. 37 반응 혼합물을 품어 ° C를 10 분. 반응 구성 요소 이외의 순서는 매우 중요합니다. 셀 – 무료 추출물은 아미노산과 변이의 활성화를 허용하도록 실온에서 5 분 incubated 최종 혼합물을 포함하는 버퍼 솔루션 첫번째 혼합해야합니다. 나중에 비오틴 – 표시 mRNAs이 추가됩니다. 화학 수정 절차를 사용하여 구조 분석을 위해, 방사성 아미노산의 추가가 필요하지 않습니다. 35 MM 트리스 – 아세테이트, 산도 8.0, 10 MM 마그네슘 아세테이트, 175 MM 칼륨 아세테이트, 10 MM의 암모늄 아세테이트와 1 ㎜의 DTT를 포함하는 버퍼 C에서 정지 streptavidin의 상자 성체의 비즈 (SMB) 3 ML – 번역 반응 혼합물에 추가합니다. 10 분 상온에서 새로운 현탁액을 품어. 자기 분리 스탠드를 사용하여 자기장 (MF)를 적용하여 혼합물에서 SMB를 구분한다. 버퍼 C에서 SMB를 Resuspend와 MF를 사용하여 다시 비즈를 구분한다. 두번 세척 절차를 반복합니다. 버퍼 C 500 μL에 비즈를 Resuspend, 얼음에 정지를 저장하고, 즉시 다음 절차를 수행합니다. 6. Peptidyl – tRNA를 포함하는 절연 변이 분석. peptidyl – tRNA에 대한 50 MM 트리스 – HCL, pH를 6.8, 2.5 % (V / V) 글리세롤, 4 %의 나트륨 dodecyl 황산염, 2 MM DTT와 0.2 MG를 포함하는 로딩 버퍼 10 μL와 SMB 10 μL를 (버퍼 C에서 정지) 믹스 / ML bromophenol 파란색. 10% 트리스 – tricine의 polyacrylamide의 젤의 샘플을 실행하여 구슬에 연결된 구성 요소를 해결합니다. 진공 젤 – 건조기를 사용하여 젤을 건조. X – 선 필름에 건조 겔을 노출하여 peptidyl – tRNA의 무결성과 정화를 확인합니다. ribosomal RNA에 대한 DEPC – 처리된 물을 준비이 당연 ethylenediaminetetraacetate (EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 솔루션을 190 μL, 그리고 비드 정지 10 μL로 물을 equilibrated 페놀 200 μL를 추가합니다. 활발한 vortexing하여 현탁액을 혼합하여 실온에서 3 분 10,000 XG에서 원심 분리하여 유기적인 단계에서 무기 단계를 구분한다. 새로운 microtube 최고의 물 레이어를 수집합니다. 3 M의 아세트산 나트륨의 10분의 1 볼륨, 산도 5.2, 20 MG / 글리코겐 솔루션, 그리고 얼음처럼 차가운 에탄올 2 볼륨 ML 1 μL를 추가하여 물 계층에서 RNA를 침전. DEPC – 처리된 물 10 μL의 RNA를 Resuspend. 아가로 오스의 젤에 전기 영동하여 ribosomal RNAS의 무결성을 확인합니다. 보통 비즈 정지 50 μL는 ribosomal RNA 1μg의 산출. 7. 대표 결과 : 그림 2에 설명된 절차를 사용하여 격리 번역 리보솜의 품질과 기능을 평가 분석의 일련의 결과를 보여줍니다. polyacrylamide의 젤에서 해결된 독특한 밴드의 관찰은 SMB (그림 2A)에 연결된 비오틴 – 표시 mRNAs에 바운드 polypeptides의 존재를 나타냅니다. 이 프로 시저를 사용하여 ribosomal RNAS의 정화는 물론, 이러한 비오틴 – 표시 mRNAs에 바운드 (그림 2B) 변이의 존재를 설정합니다. puromycin의 추가, ribosome의 peptidyl – transferase 활동을 유도 항생제, 초기 peptidyl – tRNAs 1 절단을 초래합니다. 이것은 (그림 2C) polyacrylamide의 젤에 분리된 polypeptide의 마이 그 레이션 패턴의 변화로 관찰됩니다. 함께, 이러한 데이터는 SMB에 연결된 비오틴 – 표시 mRNAs은 peptidyl – tRNAs와 기능 변이를 포함하는 것으로 나타났습니다. 특정 peptidyl – tRNAs를 포함하는 번역 리보솜의 고립은 ribosome 기능 (그림 3A)에 peptidyl – tRNAs, 항생제 및 기타 분자의 효과 연구를 허용하고, ribosome 구조 (그림 3B). 예제에서 여기 항생제 sparsomycin을 제시하고 아미노산 트립토판 (TRP)는 격리 리보솜 (그림 3A)에 RF2하여 초기 tnaC – tRNA peptidyl – tRNA 유도의 가수 분해 절단을 억제. ribosome과 sparsomycin 또는 TRP의 상호 작용은 또한 번역 ribosome (그림 3B)의 23S rRNA를 구성 일부 세포핵의 구조적 변화를 유도. 요약에서 프로 시저를 사용하여 얻은 생물 학적 물질은 다양한 분자 요소와의 상호 작용에 따라 ribosome 기능의 억제에 관련된 구조적 연락처 추가 지식을 얻기에 유용하다 여기에서 설명한. ove_content "> 그림 1. peptidyl – tRNAs를 포함하는 번역 리보솜을 생산하고 정화하는 데 사용되는 절차. DNA는 CA를 파편. 그림에 표시된 tnaC 유전자와 그 인접 지역을 포함한 길이 650 BP는, 비오틴을 [(바이오) 지금 뭐] mRNA가 포함된 mRNAs 준비에 템플릿으로 사용됩니다. 이러한 DNA 조각은 그림의 맨 위에 표시된 oligodeoxynucleotides를 사용하여 PCR 절차에 의해 생산됩니다. 밑줄 문자는 뉴클레오 티드 뇌관으로 인코딩된 T7 프로 모터의 위치를​​ 표시합니다. 볼드 문자 tnaC mRNA 시퀀스의 번역에 사용되는 샤인 – 달가노 순서를 나타냅니다. 의 DNA 조각의 T7 프로 모터는 (화살표) tnaC 시퀀스와 비 코딩 시퀀스의 하류를 녹음하는 데 사용됩니다 T7 RNA 효소에 의해 인정되고 있습니다. RNA 효소는 rpoBC 터미네이터 시퀀스 (rpoBC "T") 후, DNA 조각의 3' – 끝에 도달하면 전사가 종료됩니다. rpoBC 터미네이터의 줄기 루프 구조가 체외 번역 반응에 사용되는 셀없는 추출물의 3' – 5 'exoribonuclease 활동 현재의 mRNA를 보호합니다. 격리 [(바이오) 지금 뭐] mRNAs는 체외 번역 assays 사용하여, 지연, 번역 변이를 생성하는 데 사용됩니다. 의 tnaC 순서 [(바이오) 지금 뭐] mRNA는 반응 혼합물에서 릴리스 팩터의 부재 (RF2)에 의한 마지막 아미노산이 통합되었을 때 노점 ribosome에 의해 번역합니다. ribosome – [(바이오) 지금 뭐] mRNA의 단지가 mRNA에 통합 비오틴 – 라벨 세포핵을 바인딩 streptavidin – 자석 – 구슬 (SMB)를 사용하여 총 반응 혼합물로부터 격리됩니다. SMBs는 바운드 ribosome – [(바이오) 지금 뭐] mRNA의 단지가 자기장 (MF)를 사용하여 총 반응 혼합물에서 추출됩니다. 그림 2. 절연 단지의 구조 및 기능 분석합니다. A) 시험 관내의 변환 반응이 함께 수행했다 [(바이오) 지금 뭐] tnaC 유전자의 시작 코돈이 정지 코돈으로 대체어진 mRNAs. 최종 제품으로 그림 1에 표시됩니다, streptavidin 비즈를 사용하여 격리되었습니다. 반응 제품 및 절연 분자는 다음의 polyacrylamide 젤 전기 영동에 의해 분석되었다. tnaC – tRNA와 tnaC 펩타이드 밴드가 표시됩니다. B) 총 RNA는 페놀 추출 절차를 사용하여 지연 단지에서 고립되었다. 각각의 분리된 RNA는 아가로 오스 젤에 전기 영동에 의해 해결되었습니다. Ribosomal RNAS (rRNAs)가 표시됩니다. C) tnaC – tRNAs을 포함한 절연 단지가와 (+)없이 incubated했다 (-) 10 분 상온에서 0.02 MM puromycin (Puro). tnaC의 펩타이드는 [35S] – 메티오닌 (A) 또는 [3H] – 프롤린 (B)를 사용하여 번역하는 동안 표시되었습니다. 그림 3. 항생제 sparsomycin 또는 아미노산 트립토판에 바인딩된 tnaC – tRNA를 포함하는 리보솜의 구조 및 기능 분석합니다. A) tnaC – tRNAs을 포함한 절연 단지가와 (+) 또는 (없이 incubated 있었다 -) sparsomycin (스파) 또는 5 분 실온에서 트립토판 (TRP). 나중에 혼합은 RF2와 혼합하여 37 ° C 20 분 incubated되었습니다. B) 23S rRNA의 methylation의 변화 분석 ribosome 내에서 바인딩 분자에 의해 유도. 절연 단지가와 (+)없이 사전 incubated했다 (-) 37시 5 분 2 MM TRP 또는 스파 ° C. 그런 다음, 알킬화 대리인, 디메틸 황산은 추가되고 혼합물은 추가 20 분 실온에서 incubated했다. 총 RNA가 추출되었고 뇌관 확장 assays은 [32P] 수정된 뉴클레오 티드에서 하류 100 세포핵을 간격 아르 23S rRNA의 세포핵을 보완 – 표시 oligodeoxynucleotide 함께 수행했다. 확장 assays의 최종 제품은 polyacrylamide의 젤에 전기 영동에 의해 해결되었다. TRP이나 스파의 존재에 의해 영향을 23S rRNA의 세포핵이 표시됩니다.