In-vitro-Bildung von Biofilmen in einem 8-well Chamber Slide

1. In-vitro-Bildung von Biofilmen Bakterienkolonien (die auf geeigneten Agar über Nacht angebaut worden), wurden in den Medien ausgesetzt, und die OD 490 wurde auf 0,65 eingestellt Die daraus resultierende Bakteriensuspension wurde dann 1:6 (1 ml Bakteriensuspension + 5 ml vorgewärmten Medium) und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für ca. 3 Stunden, um bis Mitte der log-Phase zu erreichen. Verdünnen Sie die Mitte der log-Wachstumsphase Federung 1:2500 mit vorgewärmten Medien und Platz 200 ul der Verdünnung in jedes Well einer 8-well Kammer schieben. Bei 37 ° C mit 5% CO 2. Nach ca. 16 Stunden, absaugen Medium Ecke jeder Kammer und 200 ul frisch, vorgewärmten Medium – verzichten entlang Wand der Kammer, um nicht Scherkräfte innerhalb der Kammer, die den Biofilm stören könnten zu schaffen. Wenn Inkubation länger als 24 Stunden, ändern Medium alle 12 Stunden oder nach Bedarf, um bakterielle Lebensfähigkeit zu erhalten. 2. Visualisierung von Biofilm Absaugen Medium aus jeder Kammer, wie oben beschrieben, und waschen Wohnsitz Biofilm zweimal vorsichtig mit steriler Kochsalzlösung. Add 200 ul Baclight Live / Dead Fleck (3 ul Komponente A + 3 ul Komponente B pro ml Kochsalzlösung) in jede Vertiefung und inkubieren bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Schützen Kultur aus Licht von diesem Punkt an. Saugen Sie den Fleck und waschen zweimal vorsichtig mit steriler Kochsalzlösung nach wie vor. Add 200 ul neutral gepuffertem Formalin in jede Vertiefung und inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur auf Probe zu beheben. Entfernen Fixativ und ordnungsgemäß entsorgen gemäß den Richtlinien des Instituts. Zweimal waschen mit Kochsalzlösung und entsorgen Sie die Waschflüssigkeiten, dass Formalin wie oben enthalten. Entfernen Sie die Kunststoff-Brunnen aus der Folie mit ausreichend Kochsalzlösung in jede Vertiefung, so dass bei einem Deckglas auf die Dichtung gelegt wird, keine Luftblasen vorhanden sind. Deckglas und die Ränder des Deckglases mit Eindeckmedium. Nagellack kann verwendet werden, um die Folien Siegel jedoch die Folien werden nicht als dauerhaft sein werden. Lassen Sie die Versiegelung für ca. 1 Stunde trocknen, bevor über-Mikroskopie untersucht. 3. Ergebnisse Abbildung 1. Representative 3D zusammengesetzte Bilder eines Biofilms in einem 8-well Kammer schieben gebildet. Die Bakterien wurden mit Live / Dead Fleck wobei lebende Bakterien bezeichnet fluoreszieren grün und tote Bakterien leuchten rot. (A) Zusammengesetztes Bild der gesamten Biofilm zeigt eine besondere Architektur mit Türmen und Wasserkanälen. (B) Gleiche Biofilm als in (A), jetzt im Querschnitt gesehen.