Entrega directa de Morpholinos FOMIN Hacia el otocyst pez cebra por inyección y electroporación afecta el desarrollo del oído interno

1. Electrodos para la toma de electroporación Cortar 75 m de diámetro de alambre de tungsteno (AM Systems, Inc. Carlsborg, WA) de longitud adecuada (alrededor de 5.3 cm) Poner alambre de tungsteno a través de cable conector molex (latón estampado pin) Envuelva los cables de tungsteno y el conector del cable molex con tubo retráctil (SPC Technology, Chicago, IL) y aplicar calor con quemador Bunsen o una pistola de calor para sellar el tubo de la reducción al cable Para afilar la punta del alambre de tungsteno, sumergir el alambre en hidróxido de sodio 1,0 N (Conrad et al. 1993) y, con un clip en el otro electrodo, electrolizar el alambre con un Electroporador onda cuadrada. Las condiciones que utilizamos son 5 de 50 voltios con una duración de impulsos de 100 ms con 50 ms entre pulsos. Los electrodos deben ser afilados con un diámetro de 15-20 micras Mantenga los cables en una bandeja en las ranuras presionado en arcilla antes de su uso en la electroporación 2. Configurar la estación de electroporación Cinta afilada 75μm electrodos de tungsteno para micromanipulador (instrumentos de precisión Mundial). Micromanipuladores lugar a ambos lados de la platina del microscopio de disección (Leica). Conectar los electrodos a una Proteger CUY-21 Electroporador Edición de onda cuadrada (Figura 1). Encienda el electroporador y establecer parámetros para la electroporación, como el voltaje, la duración del pulso, y el número de pulsos. Los parámetros más eficaces para este experimento se encontró que tres de 13 voltios de pulsos que se prolongó durante cada 5.0ms, con 100 ms entre cada pulso. Si electroporación crea burbujas de aire en el embrión, reducir la duración del pulso. 3. Microinyección de Morpholinos Dentro vesícula ótica pez cebra Embriones de pez cebra de la cosecha de un estanque de cría. Incubar los embriones en el embrión de conciencia medio con 0,3 ppm de azul de metileno (Westerfield, 2005) a 28,5 ° C durante la noche. Tire las agujas de cristal con un extractor de Sutter P-97 electrodos Calentar una base de gel de agarosa (agarosa al 1% en los peces de agua en un 10 mm placa de Petri) a 37 ° C en un baño de agua Calentar 1% de agarosa de bajo punto de fusión (LMPA) en peces de agua hasta que se derrita y mantenerlo caliente en el baño de agua a 37 ° C. Llene una aguja de vidrio con una solución de morfolino (GeneTools, Corvallis, Oregón) y cortar la punta de diámetro apropiado. Monte la aguja de inyección en un micromanipulador (Kuhn). Cortar punta de la aguja de aproximadamente 10 micras y se inyecta en aceite mineral para asegurarse de que la punta permite la entrega suficiente de solución de morfolino. Dechorinate embriones a las 24 horas postfertilización (HPF) y anestesia con MS222 (tricaína, Sigma) en agua 0,3 PPM pescado azul de metileno. Alinear 3 a 5 embriones anestesiado en la base de gel de agarosa con el lado derecho para el análisis uniforme conveniente Ponga 1 a 2 gotas de 1% sobre LMPA cada embrión y dejar solidificar a fijar el embrión en su lugar Gire la placa de Petri para que la vesícula ótica se encuentra en el lado derecho Coloque la aguja en el lumen de la vesícula ótica e inyectar la solución morfolino con un neumático PicoPump PV820 (Instrumentos del Mundo de Precisión) con un tanque de nitrógeno unido (Figura 2) 4. Electroporación procedimiento Mueva los embriones montado en la estación de electroporación inmediatamente después de la inyección Coloque el electrodo positivo en el tejido que está por detrás de la vesícula ótica, pero no penetran, insertar el electrodo negativo en el cerebro, justo por delante de la vesícula ótica Aplicar actual mediante un pedal o pulsar un interruptor. Vierta el agua los peces de agarosa y eliminar los embriones de agarosa con remolinos y una pipeta de vidrio. Tenga cuidado de no dañar los embriones. Para los embriones que son difíciles de eliminar, el uso de una aguja para romper con suavidad a la basura cualquier LMPA que rodea al embrión. Embriones a cabo en un plato con pescado de agua azul de metileno y elevar los embriones a los escenarios deseados para el análisis (morfológico, inmunohistoquímico, en anlaysis hibridación in situ, etc y microscópicas). 5. Los resultados representativos: Figura 1. Estación de electroporación. Los electrodos se realiza mediante cables de tungsteno afilada 75μm y conectados por cables a una Proteger CUY-21 Electroporador onda Editar Square. Estos electrodos fueron grabadas a micromanipulador. Figura 2. Estación de inyección. Todos los embriones fueron inyectados en el oído derecho, para fines de normalización. Figura 3. Faloidina tinción de los filamentos de actina con 3 embriones fdd. (A) El embrión 3 fdd injected con el control de MO tiene una fuerte tinción de phalloidin en la mácula posterior (pm). (B) El embrión que fue inyectado con el control de MO y luego electroporated tenían niveles similares de tinción phalloidin en la tarde en los embriones de inyección única. (C) Inyección de la OM del FOMIN en la vesícula ótica por sí sola no causa la reducción de la tinción phalloidin, mientras que la inyección de MOs FOMIN junto con la electroporación causado una drástica reducción de la tinción phalloidin en la tarde (D). am, mácula anterior. Figura 4. Manchas faloidina de filamentos de actina con larvas DPF 5. No hubo diferencias entre la inyección única (A) y la inyección con la electroporación, cuando la norma morfolino de control se utilizó (B). Sin embargo, las larvas DPF 5 que fueron inyectados con mif morfolinos y electroporated demostraron una reducción de tinción phalloidin en la mácula posterior (pm) (D), aunque menos pronunciado que tres fdd, cuando se compara con el embrión que fue inyectado con mif morfolinos sólo (C ). am, mácula anterior. Figura 5. Tinción tubulina acetilada de los embriones a los 3 fdd. El embrión en (A) no recibió ninguna inyección o electroporación. El embrión en (B) se electroporated pero no recibió ninguna inyección. Los embriones que reciben tanto de la inyección y la electroporación (C, D) con mif morfolinos había disminuido visiblemente manchas tubulina en comparación con los controles. (Por la tarde, la mácula posterior). Figura 6. Tinción tubulina acetilada de los embriones a los 3 fdd con el control de morfolino. (A) de embriones sin ningún tipo de tratamiento mostraron una fuerte tinción tubulina acetilada en la mácula posterior (pm) y la inervación extensa. (B) de embriones inyectados con el control de morfolino. (C) de embriones tratados con la electroporación solamente. (D) de embriones de control con el control de morfolino inyectado y electroporated tiene niveles similares de tubulina acetilada en la mácula y la inervación posterior comparación con el control sin tratamiento.