Eine Methode, um Morpholinos direkt liefern in der Zebrafisch otocyst bei 24hpf entwickelt worden. Mit Mikroinjektion von Morpholinos in das Lumen des otic Vesikel und Elektroporation, um das Eindringen Effekt, konnten wir die Wirkung von Morpholinos auf das Gehirn zu umgehen und erhalten Wirkungen, die spezifisch an das Innenohr.
In den letzten Jahren hat Elektroporation zu einer beliebten Methode zur in-vivo-Transfektion von DNA, RNA und Morpholinos in verschiedenen Geweben, einschließlich der Augen, des Gehirns und Somiten der Zebrafisch. Der Vorteil der Elektroporation gegenüber anderen Methoden der genetischen Manipulation ist, dass bestimmte Gewebe gezielt können, sowohl räumlich als auch zeitlich, denn die Einführung von Makromolekülen durch die Anwendung von elektrischem Strom. Hier beschreiben wir den Einsatz der Elektroporation zur Transfektion von MIF und MIF-like Morpholinos in das Gewebe des sich entwickelnden Innenohr des Zebrafisch. In früheren Studien, mif Morpholino in Embryonen im 1 eingespritzt – bis 8-Zell-Stadium führte zu weit verbreiteten morphologischen Veränderungen im Nervensystem und Auge sowie das Ohr. Durch die Ausrichtung der Gewebe des Innenohrs in späteren Phasen in der Entwicklung, können wir die primären Auswirkungen von MIF in den Entwicklungsländern Innenohr zu bestimmen, um sekundäre Effekte, die sich aus dem Einfluss von anderen Geweben führen kann entgegengesetzt. Durch die Verwendung von Phalloidin und acetyliertes Tubulin-Färbung, um die Morphologie von Neuronen, neuronale Prozesse und Haarzellen mit der hinteren Makula verbunden Studie konnten wir die Wirksamkeit der Elektroporation als Methode zur gezielten Transfektion in der Zebrafisch Innenohr zu beurteilen. Die otic Vesikel 24hpf Embryonen wurden mit Morpholinos und elektroporiert injiziert und wurden dann zu Embryonen, die keine Behandlung erhalten hatten oder bisher nur gespritzt oder elektroporiert verglichen. Embryonen, die injiziert und wurden elektroporiert zeigten eine Abnahme der Haarzelle Zahlen, verringerte Innervation durch die statoacoustic Ganglion (SAG) und weniger SAG Neuronen im Vergleich mit Kontrollgruppen. Unsere Ergebnisse zeigten, dass die direkte Lieferung von Morpholinos in otocysts in späteren Stadien der unspezifischen Nervensystem und Neuralleiste Auswirkungen Morpholinos am 1-8 Zell-Stadium geliefert vermeidet. Darüber hinaus ermöglicht die Untersuchung von Effekten, die an das Innenohr und nicht sekundäre Effekte auf das Ohr von primären Auswirkungen auf das Gehirn, Neuralleiste oder periotischen Mesenchym gerichtet sind.
Wir haben erfolgreich Antisense-Oligonukleotid MOs in das Ohr des 24 hpf Zebrafischembryo eingeführt. Embryonen, die nach der Injektion und Elektroporation erhöht wurden lebensfähig. Wenn die Embryonen überlebten die Elektroporation, wuchsen sie zu normalen Tarifen im Vergleich zu Embryonen, die keine Behandlung, sowie Embryonen, die nur injiziert worden war und Embryonen, die erst seit elektroporiert erhalten hatte.
Wir beobachteten die Wirkung von MIF und MIF-like MOs nach Ohr Injektion und Elektroporation durch die Kennzeichnung mit Phalloidin und acetyliertes Tubulin. Phalloidin-Färbung von Aktin-Filamenten in sensorischen Haarzellen des hinteren Makula zeigt an, dass die Elektroporation von MIF und MIF-like MO an der 24-hpf Bühne verursacht Veränderungen in Haarzellen und / oder Stereozilien Zahlen, wenn Embryonen, die nur mit der MOs injiziert wurden im Vergleich (Abbildung 3). Dieser Rückgang in Haarzellen Zahlen stimmen mit den Ergebnissen von Shen et al. (Submitted), die MOs zu mif und mif-wie eine Reduzierung der Anzahl der Haarzellen in der sackförmigen Makula verursachen. Der Rückgang der Haare Zellzahlen in Embryonen, die mit MOs und elektroporiert injiziert wurden zeigen, dass der Elektroporation kann bei der Bewegung der MOs durch die Zellmembran Hilfe, wodurch das Ausmaß der morphologischen Auswirkungen bei Embryonen, in denen die otic Vesikel nur injiziert wurde verglichen. Änderungen in der Morphologie der statoacoustic Ganglion wurden durch acetyliertes Tubulin-Färbung beobachtet. Das Ausmaß der Innervation durch die statoacoustic ganglion betroffen war, als Embryonen, die injiziert und wurden elektroporiert zeigen verringerte Verzweigung der Neuriten (Abbildung 5). Es kann auch Kondensation der Ganglienzellen und / oder eine verringerte Zahl von Ganglienzellen verringert werden, weil die acetylierten Tubulin-Färbung ist deutlich in Embryonen, die sowohl injiziert wurden und Elektroporation verringert. Da mif gezeigt worden ist, kritisch zu sein für die Entwicklung des Nervensystems (Suzuki et al., 2004), können die Änderungen nach der Elektroporation gesehen das Ergebnis der erhöhten Transfektion der mif und mif-like MO-Lösung in den Neuroblasten Zellen werden.
Elektroporation von Antisense-Oligo Morpholinos direkt in ein Entwicklungsland Gewebe ist ein nützliches Werkzeug für die Steuerung der Expression eines Gens in das Gewebe der Entwicklung, sowohl räumlich als auch zeitlich, in den Embryo. Elektroporation von MIF und MIF-like MOs in das Gewebe des Innenohrs ergab anormale Morphologie der beiden hinteren Makula und die statoacoustic Ganglion. Es wurde eine Reduktion in der Anzahl der Haarzellen in der hinteren Makula in Embryonen, die injiziert worden war und im Vergleich mit Embryonen, die keine Behandlung erhalten hatten oder mit Embryonen, die entweder war nur gespritzt oder nur elektroporiert elektroporiert. Es gab auch eine Abnahme der Grad der Innervation der hinteren sensorischen Patch von der statoacoustic Ganglion und die Größe der SAG. Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von Makromolekülen in bestimmten Geweben, mit dem Vorteil der Beobachtung der primären Auswirkungen des jeweiligen DNA, RNA, oder MO in das gewünschte Gewebe und diskriminierende diese von Nebenwirkungen auf andere Gewebe einschließlich des Gehirns, Neuralleiste und periotischen Mesenchym am Innenohr Entwicklung (Barald und Kelley, 2004).
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Taubheit Research Foundation zu Yc S und der NSF (IOS 0930096) zu KFB unterstützt.
KFB: NIH / NINDCD 2 RO1 DC04184, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096
Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
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Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
Modeling clay | Supply | |||
Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
6 well plastic plates | Supply | Falcon |