Livraison directe de morpholinos MIF Into the otocyste Zebrafish par injection et électroporation affecte le développement oreille interne

1. Fabrication d'électrodes pour l'électroporation Couper 75 fils de tungstène um de diamètre (PM Systems, Inc Carlsborg, WA) de longueur appropriée (environ 3-5 cm) Passez le fil de tungstène grâce molex câble connecteur (broche en laiton estampé) Envelopper et des fils de tungstène connecteur du câble molex avec gaine thermorétractable (CPS Technology, Chicago, IL) et appliquer de la chaleur avec brûleur Bunsen ou pistolet à air chaud pour sceller le tube rétrécit au fil Pour affûter la pointe de fil de tungstène, tremper le fil dans l'hydroxyde de sodium 1,0 N (Conrad et al. 1993) et, à l'aide d'un trombone que l'autre électrode, électrolyse le fil avec un Electroporateur onde carrée. Les conditions que nous utilisons sont de 5 à 50 volts impulsions d'une durée de 100 ms avec 50 ms entre les impulsions. Les électrodes doivent être affûtées à un diamètre de 15 à 20 um Gardez les fils dans un plateau dans les rainures enfoncé dans la pâte à modeler avant l'utilisation dans l'électroporation 2. Set Up station électroporation Ruban aiguisé 75μm électrodes de tungstène pour micromanipulateurs (instruments de précision du monde). Micromanipulateurs place de chaque côté de la platine du microscope disséquant (Leica). Brancher les électrodes à un Protéger CUY-21 Electroporateur Modifier Place des vagues (figure 1). Allumez le électroporateur et mettre en place des paramètres pour l'électroporation, y compris la tension, durée d'impulsion, et le nombre d'impulsions. Les paramètres les plus efficaces pour cette expérience ont été trouvés être de trois 13 volts impulsions qui ont duré chacune des 5.0ms, avec 100ms entre chaque impulsion. Si l'électroporation crée des bulles d'air dans l'embryon, de réduire la durée d'impulsion. 3. Microinjection d'morpholinos Into vésicule otique Zebrafish Embryons de poissons zèbres récolte à partir d'un réservoir d'élevage. Incuber les embryons dans l'embryon de conscience moyenne, avec 0,3 PPM méthylène bleu (Westerfield, 2005) à 28,5 ° C pendant la nuit. Tirez aiguilles de verre avec un extracteur Sutter P-97 électrodes Warm up une base de gel d'agarose (1% d'agarose dans de l'eau du poisson dans un plat de Pétri de 10 mm) à 37 ° C dans un bain d'eau Chauffer 1% d'agarose à faible point de fusion (EPMT) dans les poissons d'eau jusqu'à ce qu'il fonde et le garder au chaud dans le bain à 37 ° C. Remplir une aiguille de verre avec une solution morpholino (GeneTools, Corvallis, OR) et couper l'extrémité d'un diamètre approprié. Montez l'aiguille d'injection sur un micromanipulateur (Kuhn). Couper pointe de l'aiguille d'environ 10 um et les injecter dans l'huile minérale pour s'assurer que la pointe permet une livraison suffisante de solution morpholino. Dechorinate embryons à 24 heures post-fécondation (HPF) et les anesthésier avec MS222 (tricaïne, Sigma) dans 0,3 ppm d'eau de méthylène poisson bleu. Alignez 3 à 5 embryons anesthésiés sur la base de gel d'agarose avec le côté droit pour analyse uniforme commodes Mettre 1 à 2 gouttes d'EPMT 1% sur chaque embryon et laissez solidifier à fixer l'embryon en place Tournez la boîte de Pétri de telle sorte que la vésicule otique est sur le côté droit Placez l'aiguille dans la lumière de la vésicule otique et injecter la solution avec un morpholino PicoPump PV820 pneumatique (instruments de précision du monde) avec un réservoir d'azote fixé (figure 2) 4. Procédure d'électroporation Déplacer les embryons montée à la station de électroporation immédiatement après l'injection Placer l'électrode positive sur le tissu juste derrière la vésicule otique, mais ne pénètrent pas, insérer l'électrode négative dans le cerveau juste en avant la vésicule otique Appliquer en cours en utilisant une pédale ou en appuyant sur un interrupteur. Versez de l'eau du poisson sur agarose et retirez embryons à partir d'agarose tourbillonnant et une pipette en verre. Faites preuve de prudence pour ne pas endommager l'embryon. Pour les embryons qui sont difficiles à enlever, utiliser une aiguille doucement rompre toute EPMT entourant l'embryon. Embryons Placer dans un plat avec de l'eau du poisson bleu de méthylène et d'élever les embryons à des stades souhaités pour l'analyse (morphologique, immunohistochimique, dans anlaysis hybridation, etc et microscopiques in situ). 5. Les résultats représentatifs: Figure 1. Station de l'électroporation. Les électrodes ont été faites en utilisant des fils de tungstène affûté 75μm et reliés par un conduit Protéger CUY-21 Electroporateur Modifier onde carrée. Ces électrodes ont été enregistrées au micromanipulateurs. Figure 2. Station d'injection. Tous les embryons ont été injectés dans l'oreille droite à des fins de normalisation. Figure 3. Coloration phalloïdine des filaments d'actine avec 3 embryons DPF. (A) L'embryon injecte 3 dpfD avec contrôle MO a une forte coloration de la phalloïdine dans la macula postérieur (pm). (B) L'embryon qui a été injecté avec un contrôle MO puis électroporées avaient des niveaux similaires de coloration phalloïdine dans h dans les embryons d'injection seulement. (C) l'injection avec MOS mif dans la vésicule otique seul ne cause pas de réduction de la coloration phalloïdine, tandis que l'injection d'OM mif avec électroporation a provoqué une réduction spectaculaire de la coloration de la phalloïdine h (D). h, la macula antérieure. Figure 4. Coloration phalloïdine des filaments d'actine avec 5 larves DPF. Il n'y avait aucune différence entre l'injection seulement (A) et l'injection de l'électroporation, lorsque la norme de contrôle a été utilisé morpholino (B). Cependant, les larves 5 dpf qui ont été injectés avec mif morpholinos et électroporé montré réduite coloration phalloïdine dans la macula postérieure (h) (D), bien que moins spectaculaire que trois DPF, en comparaison avec l'embryon qui a été injecté avec mif morpholinos seulement (C ). h, la macula antérieure. Figure 5. Coloration tubuline acétylée d'embryons à 3 dpf. L'embryon en (A) n'a pas reçu d'injection ou l'électroporation. L'embryon en (B) a été électroporé mais n'a reçu aucune injection. Embryons recevoir l'injection et l'électroporation (C, D) avec mif morpholinos avaient visiblement coloration tubuline diminué par rapport aux contrôles. (H, macula postérieur). Figure 6. Coloration tubuline acétylée d'embryons à 3 dpf avec contrôle morpholino. (A) Embryon sans aucun traitement a montré une forte coloration tubuline acétylée dans la macula postérieur (pm) et l'innervation étendue. (B) avec contrôle de l'embryon injecté morpholino. (C) Embryon traités avec électroporation seulement. (D) d'embryon commande avec morpholino injecté et électroporées a des niveaux similaires de la tubuline acétylée dans la macula et l'innervation postérieure par rapport au témoin un traitement non.