NanoART производства 1. Влажные NanoART фрезерный по NETZSCH MicroCer методы Взвесьте наркотиков кристаллов и различных поверхностно-активных веществ, который будет использоваться, чтобы сделать nanoformulations использованием аналитических весов и смешайте их с 10 мМ Hepes буфере, рН 7,8 использованием Т-18 Ultraturrax миксером до полностью рассеялись. Процентов наркотиков в формулировке должна быть в пределах 1 – 2%. Для непрерывного фрезерования, убедитесь, что чиллер и компрессор включен. Давление на выходе должно быть около 100 PSI, прежде чем начать мельницу вашего образца. Включите блок управления и поворота шлифовального бак, так что мелющих тел могут быть загружены в бак. Добавьте 50 мл бисером камеры измельчения использованием воронки. Убедитесь в том, что Есть нет бусины темы или где-нибудь за пределами камеры измельчения, чтобы избежать утечки в механическое уплотнение. Убедитесь, что уплотнительное кольцо на его место на фрезерном камеры. Выберите подходящий размер сито и использовать соответствующую сборку крышки и безопасный крышками, затянув гайки. Размер экрана по сетке должно быть не менее половины размера бисера. Использование большого размера сито, чтобы избежать продукт от засорения фильтра в то время как непрерывный фрезерования. Нижние камеры измельчения, чтобы сделать его горизонтальным помощью ручки предоставляется на верхней части камеры и убедитесь, что продукт отводной трубки впадает в приемный сосуд. Добавить наркотиков подвеска с различными количествами поверхностно-активных веществ продукта на входе. Минимальный объем подвески должно быть 100 мл. Это позволит предотвратить фрезерные камеру от перегрева, а также избежать загрязнения бусину из-за меньшего износа на детали Начало насоса с помощью блока управления. Скорость потока можно изменять по мере необходимости для вашей формулировке (~ 50 – 150 мл / мин). Включите мешалку и настройте скорость на блоке управления. Скорость может быть увеличена с 620 оборотов в минуту до 4320 оборотов в минуту на MicroCer. Монитор температуры с помощью датчика температуры, который прилагается на первое место по камере измельчения и убедитесь, что нет перегрева. Милль образца при различных скоростях и скорость потока и доставать небольшие порции (~ 1 мл) препарата для размера и заряда измерений с помощью дифракционного рассеяния света Брукхейвенской Zetasizer (табл. 1). После нужного размера получается, остановитесь фрезерные использованием блока управления. С насосом еще включен, собирать пробы в колбе. Разрешить препарат полностью стечь в колбу отбора проб. Выключите насос. Для удаления бусы, место коллекции лоток под блок. Ослабить гайки на передней панели крышки сборки и собрать бусины в лоток. Снимите переднюю панель и использование деионизированной бутылку воды, чтобы смыть бисером в лоток. Передача фрезерованные суспензии в 50 мл трубы центрифуги и установить центрифуги до 10000 оборотов в минуту (10174 RCF) в течение 30 минут. После завершения цикла центрифуги, измерить количество надосадочной и заменить такое же количество свежего раствора ПАВ. После ресуспендирования завершения передачи подвески в камеру измельчения и мельница на 10 минут. Возьмите аликвоту (~ 1 мл) и измерить размер и заряд пример еще раз, используя Zetasizer (табл. 1). Выполните после использования очистки MicroCer использованием деионизированной воды и 70% этанола. Мера концентрации nanoART формулировки использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. В нашем случае, мы оценивали образцы с обращенной фазовой ВЭЖХ использованием трех экземплярах 20 мкл инъекции на колонке YMC Октил C8 (Waters Inc, Милфорд, штат Массачусетс) с C8 охранник картриджа. Подвижная фаза, состоящая из 48% ацетонитрила / 52% 25 мМ KH 2 PO 4, рН 4,15 перекачивается в 0,4 мл / мин с UV / Vis обнаружение при 272 нм. Для всех наркотиков измерения, количественный определяется путем сравнения со стандартной кривой каждого свободного препарата (0.025-100 мкг / мл), подготовленный в метаноле. 2. NanoART усреднении использованием Авестин EmulsiFlex C5 Мера наркотиков кристаллов и различных поверхностно-активных веществ, который будет использоваться, чтобы сделать nanoformulations использованием аналитических весов и смешайте их с 10 мМ Hepes буфере, рН 7,8 использованием Т-18 Ultraturrax смесителя для получения полной дисперсии. Передача подвески гомогенизации судна и начать рециркуляции. Убедитесь, что чиллер на, прежде чем начать гомогенизации образца Увеличение давления постепенно, пока индикатор не покажет 20000 ± 2000 фунтов на квадратный дюйм и продолжают гомогенизации до размера частицы-мишени достигается. Это обычно занимает от 45 – 60 минут. Возьмите аликвоту (~ 1 мл) и периодически измерять размер и заряд образца с помощью Zetasizer (табл. 1). Передача гомогенизированный отстранение от гомогенизатор до 50 мл трубы центрифуги и установить центрифуги до 10000 оборотов в минуту (10174 RCF) в течение 30 минут. По завершениюЦентрифуга цикла, измерить количество надосадочной и заменить равным объемом свежего раствора ПАВ. После ресуспендирования, передача подвески C5 гомогенизатора. Перезагрузите обращения и возврата гомогенизации давления до 20000 ± 2000 фунтов на квадратный дюйм и гомогенизации в течение 30 минут. Измерьте размер и заряд формулировка использованием Zetasizer (табл. 1). Действия после очистки блока с деионизированной воды и этанола в качестве растворителя. Мера концентрации образцов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. 3. Ультразвуком использованием Коул Пармер Ультразвуковая процессор Мера 50 мл дихлорметана в стеклянную мензурку. Мера 6 г поли (молочная-со-гликолевой кислоты) (PLGA), используя аналитические весы, добавить к дихлорметана и перемешивают до полного растворения наблюдается. Мера 1,25 г препарата кристаллов и добавить в дихлорметан / PLGA решение. Смешайте до получения полного растворения. Сделать 1% поливинилового спирта (ПВС), раствора ПАВ и прохладный его с помощью ледяной бане. Убедитесь, что поверхностно-активное вещество решение остыть перед добавлением органический раствор, который содержит растворенный препарат. Налейте наркотиков раствор в 1% раствор поверхностно-активного вещества ПВА и начать ultrasonicator на 50% амплитуды. Убедитесь, что поверхностно-активное вещество раствора помещают в ледяную баню. Амплитуда sonicator может быть уменьшена до ~ 30% амплитуды для небольших партий образцов. Разрушать ультразвуком образца в течение 10 минут. Возьмите небольшую аликвоту (~ 1 мл) для анализа размера частиц (табл. 1). Если размер частиц больше, чем 1,5 мкм, разрушать ультразвуком образца в 2-минутным интервалом до максимум 16 минут всего. Обратите внимание на образцы под микроскопом на 20x и документ наблюдения (рис. 1А). Используйте мешалки для создания адекватной вихрь для остальных подвески и продолжают перемешивание в течение ночи при комнатной температуре. Взвесьте 8 г маннита в колбу и добавляют 80 мл воды RO. Смешайте до полного растворения наблюдается и хранить при комнатной температуре. Это будет использовано для ресуспендирования после центрифугирования, если образцы должны быть лиофилизируют. Сбор суспензии после 24 часов и вылить в 50 мл трубы центрифуги. Центрифуга образцов при скорости 8000 оборотов в минуту в течение 20 минут при температуре 5 ° C. Декантируйте супернатант и ресуспендируйте половины выборки в 75 мл с фильтром обратного осмоса (RO) воды, а другая половина в 75 мл 0,5% цетиловый бромид триметиламмония (СТАВ) ПАВ. Центрифуга образцы снова со скоростью 8000 оборотов в минуту в течение 20 минут при температуре 5 ° C и ресуспендируют каждую из гранул в общей сложности 20 мл маннитола решение. После второго ресуспендирования, измерять размеры частиц с помощью Zetasizer (табл. 1). Используйте подходящие флаконах перевести оставшуюся подвески и поместить их в лиофилизатор. Мера концентрации образцов с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. 4. NanoART Морфология Возьмите nanoART подвески и кратко разрушать ультразвуком при 20% амплитуды в течение 5 секунд с ультразвуком зонда. Передача 10 мкл суспензии в 1,5 мл воды RO в 1,7 мл трубки микроцентрифужных и вихревые течение 10 секунд. Возьмите 50 мкл образца воды nanoART решения и передачи фильтрации аппарат, состоящий из 13 Swinnex полипропилена держатель фильтра в сборе с 0,2 мкм поликарбоната мембранной фильтрации (Nuclepore трековых). Фильтрации аппарат загрунтовать 50 мкл 0,2 мкм фильтруется дистиллированной водой перед добавлением разбавленной суспензии препарата. Вакуумные затем применяется к аппарату, пока весь объем раствора была полностью вытянута прошлом мембранной фильтрации. Как только оболочка сухая, она прикреплена к алюминиевой заглушкой контактный помощью двойных палку проводящие ленты углерода и распыления покрытый палладием. Образце заглушка то отображаемого используя, в нашем случае, JEOL JSM6300F низкого напряжения, полевая эмиссия сканирующего электронного микроскопа (рис. 2). 5. NanoART Визуализация Возьмите подготовленный суспензий nanoART и разрушать ультразвуком их в течение 10 секунд при 20% амплитуды ультразвука зонда. Возьмите крышку стекло микроскопа скольжения и поместите его на инвертированный микроскоп. На обложке скольжения смесь 15 мкл nanoART подвеска с 100 мкл фосфатно-солевым буфером (PBS) и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз. Визуализация наночастиц использованием 20x цели (рис. 3). Биология nanoART 6. Выделение и подготовка кровью Моноцитарный и моноцитарных Макрофаги (MDM) Получить человеческих моноцитов по лейкафереза от ВИЧ-1 и доноров гепатита серонегативных и очистить клетки против течения центробежные отмучивания. Оценка ячейки чистоту immunolabeling с анти-CD68 (клон КП-1) Из Райт-окрашенных cytospins 1. Культура очищенной моноцитов в DMEM с добавлением 10% тепла инактивированной объединенных человеческой сыворотки, 1% глютамина, 50 мкг / мл гентамицина, 10 мкг / мл ципрофлоксацина и 1000 Ед / мл рекомбинантного человеческого макрофаг колониестимулирующий фактор (MCSF) в концентрации 1×10 6 кл / мл при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO 2. Пластина 2х10 6 клеток на лунку в 6-луночных планшетах и культуры клеток в течение 7 дней, чтобы позволить моноцитов дифференцироваться в макрофагах 1. (Рис. 3А) 7. Поглощение клеток и коллекции Смешать с nanoART медиакультуры (без MCSF) до конечной концентрации 100 мкМ и добавьте 1 мл лечение среду в каждую лунку. В нужное время пункта, или когда клетки полностью загружены nanoART (рис. 2), удалите все лечение средних и мыть клетки 3 раза с 1 мл PBS для удаления частиц, которые не были приняты в клетками. В 1 мл ФСБ, удалить прилипшие клетки со дна и с помощью ячейки ручка и поместить их в 1,7 мл микроцентрифужную пробирку 2-4. Центрифуга клеток на 1000 RCF при 4 ° С в течение 10 минут. Удалить супернатант и добавить 200 мкл 100% метанола. Lyse клетки и растворяет nanoART кратковременным (2-5 секунды) sonicating гранулу sonicating зонд на уровне 20% амплитуды. Магазин образцов в -80 ° С до готовности для анализа наркотиков содержания. 8. Внутриклеточное Сохранение NanoART Лечить МДМ, как описано в 7.1. В нужное время точки, мыть клетки, как описано в 7.2, но вместо того чтобы немедленно очищая клетки, исправить клетки в течение 15 мин при комнатной температуре в растворе 3% глутарового альдегида в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) и в дальнейшем исправить их в течение 10 минут с 1% осмия в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4). Удалить фиксатор и скрести клеток в 1 мл PBS, как описано в п. 7.2. Кроме того, сбор и центрифуги клетки, как описано в 7.2, но вместо добавления метанола в гранулах, добавить 200 мкл раствора глутаральдегида фиксатором. Вырезать осадок клеток в тонкие (80 нм) секций с микротоме. Пятно секций с уранилацетатом и цитратом свинца. Соблюдайте окрашенные срезы использованием просвечивающей электронной микроскопии (рис. 4). 9. АРТ выпуска Лечить клетки, как описано в 7.1-7.2, однако вместо сбора клеток после мытья, заменить PBS с 2 мл клеточной культуры носителе без MCSF и без nanoART. В указанные дни, или, как указано по мобильному культуральной среде желтеют, обмен половине среды. В нужный день, собирают 1 мл клеточной среде, а также копировать клетки, как описано в 7.2-7.3. Процесс клетки, как описано в 7.3. Рабочей среды путем добавления 150 мкл среднего образца до 1 мл на 100% метанола и вихря на полной скорости в течение 10 секунд. Затем центрифугу образцов при 21000 RCF течение 10 минут. Удалить супернатант и перенести его на новую трубу. Evaporate метанола с вакуумной центрифуге, что может занять от 1 до 4 часов в зависимости от образца. Магазин образцов в -80 ° С до готовности для анализа наркотиков. 10. В режиме реального времени Поглощение NanoART по конфокальной микроскопии Возьмите зрелые МДМ с шагом 6,2 и этикетки клетки, используя решение ячейки маркировки таких как Vybrant Решение маркировки сотовых следующие инструкции производителя. Промойте клетки 3 раза с использованием 1 мл питательной среды, чтобы удалить лишнюю краску. Смешайте nanoART культуральной средой, как в шаге 7,1 использованием флуоресцентно меченных nanoART. Добавить лечения среду с мечеными nanoART непосредственно перед началом съемки с конфокальной микроскопии. Захват изображения каждые 30 секунд в течение 4 часов при использовании 60x цель 5 (Видео 1 и 2). ВИЧ-1 инфекции и Инфекционность Анализы 11. ВИЧ-1 инфекции ADA Лечить клетки, как описано в 9.1-9.3. На желаемого дней, удалить все средние и заменить среды, без MCSF, содержащий ВИЧ-1 ADA при множественности заражения вирусные частицы 0,01 / элемент и инкубировать в течение 24 часов 1. Удалить вирусное средних и заменить свежей, вирусов СМИ. Культуры клеток для 10 дней обмен половину среды через день или по мере необходимости сохранить клетки живыми (рис. 5) 6. Через десять дней после заражения собрать 10 мкл среды из каждой лунки, место в 96-луночного планшета, и хранить при температуре -80 ° С до готовности выполнять ретровирусной (реверс) транскриптазы анализа. 12. Обратной транскриптазы (RT) Пробирной С каждым 10 мкл образца, начиная с шага 11,3, смешайте 10 мкл раствора, содержащего 100 мМ Трис-HCl (рН 7,9), 300 мМ KCl, 10 мМ ДТТ, 0,1% нонил phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), и воды. Выдержите эту смесь в течение 15 минут при температуре 37 ° C 7. <l я> Затем добавить 25 мкл раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl (рН 7,9), 150 мМ KCl, 5 мМ DTT, 15 мМ MgCl 2, 0,05% NP-40, 10 мкг / мл поли (А), 0,250 Ед / мл олиго й (Т) 12-18 и 10 мкКи / мл 3 H-TTP в каждую лунку и инкубировать при 37 ° С в течение 18 часов 7. После инкубации, добавить 50 мкл ледяной 10% трихлоруксусной кислоты (ТСА) в каждую лунку. Урожай скважин на фильтры из стекловолокна, а также оценить фильтры для 3 Н-TTP включение путем β-сцинтилляционных спектроскопии 7. 13. ВИЧ-1p24 обнаружений Вымойте повторить клетки, из которых ретровирусных образец среда транскриптазы был удален в шаге 11,3 промыванием 1 мл PBS 3 раза. Fix клетки с 4% параформальдегида течение ночи при 4 ° C. На следующее утро промыть клетки 3 раза PBS. Используйте мышь, моноклональные антитела к ВИЧ-1 р24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) для визуализации ВИЧ-инфекции. Изображение клетки при ярком поле с помощью 40x цели (рис. 6). 14. Представитель Результаты: Наркотик Размер (Нм) PDI Заряд (Мв) Поверхностно-активные вещества IDV 1052 0,286 -24,58 0,5% P188, 5,0% SDS, 9,25% сахарозы RTV 233 0,273 -7,47 0,5% P188, 9,25% сахарозы ATZ 840 0,192 25,47 0,5% P188, 0,1% MPEG 2000-DSPE, 1,0% DOTAP, 9,25% сахарозы EFV 347 0,235 -13,52 1,0% ПВА Таблица 1. Физические характеристики nanoART Таблица показывает возможные значения представитель физические характеристики nanoART составы производятся с использованием указанных поверхностно-активных веществ. Значения включают среднего диаметра основан на интенсивность рассеянного света, полидисперсности (PDI, оценки распределения частиц по размерам), а также потенциальные дзета значения, полученные для различных образцов nanoformulation. Сокращения, используемые в таблице: IDV: индинавир; РТВ: ритонавир, ATV: атазанавир; EFV: effavirenz; PVA: поливинилового спирта; SDS додецилсульфата натрия; P188: полоксамер 188 (также называется Pluronic F68); MPEG 2000-DSPE: метил-поли (этилен-гликоль) 1,2-distearoyl-фосфатидил-этаноламин; DOTAP: (1-олеоил-2-[6 – [(7-нитро-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-ил) амино] гексаноил] – 3-триметиламмония пропана. Рисунок 1. Схема обобщения различных методов, используемых для производства nanoART. На рисунке 1 приведены различные методы, используемые для производства nanoART. Схема включает в себя предполагаемое время перераспределения для каждого из критических фаз соответствующих методов. Рисунок 2. Представителю образы желательных и нежелательных NanoART морфологии. Сканирующей электронной микроскопии анализа (увеличение, 15000 Х) RTV nanoART производства гомогенизации, мокрого помола и обработки ультразвуком в верхней части 0,2 мкм мембранной фильтрации поликарбоната. Мера бар равна 2,0 мкм во всех кадрах. Желательно nanoART состоят, в среднем, малых (≤ 2 мкм) автономный частиц с гладкими краями, которые, как правило, имеют такие же или аналогичные формы. Нежелательные nanoART сильно различаются по размерам и форме и могут сливаться и / или прилипают друг к другу. Рисунок 3. Изображения желательное решение nanoART и МДМ занимая nanoART. Яркий микроскопии изображений (все, приобретенный с помощью 20x цель) гомогенизированных РТВ-NP и МДМ занимая nanoART. После объединения 10 мкл РТВ-NP решение с 100 мкл PBS в верхней части скольжения покровного стекла, частицы видны и напоминают песок и только немногие из более крупных частиц их индивидуальной идентификации (A). Изображение полностью дифференцирована и веретенообразную форму МДМ перед nanoART лечения (B). После клетки заняли nanoART, они становятся темнее и их ядра становятся все более очевидными в связи с перинуклеарные распределение nanoART, однако они все еще сохраняют свою веретенообразную форму тела клетки (С). Как только клетки становятся перегруженными nanoART, ядра становятся затемняется, и клетки становятся округлыми, теряя свои шпинделя образной структуры и, возможно, отходящие от дна колодца (D). 4 "/> Рисунок 4. Подтверждение сотовой включение nanoART в МДМ. Просвечивающей электронной микроскопии (увеличение, 15000 х) демонстрирует поглощение nanoART в МДМ подвергается RTV-НП от гомогенизации (), RTV-НП от мокрого помола (B), RTV-NP с ультразвуком (С), и необработанных клеток (D ). В клетках, nanoART должны быть легко распознать по их геометрической формы. Обратите внимание на отсутствие каких-либо очевидных геометрических структур в контрольной ячейке (D). Например каждой частицы наметилась: красный для гомогенизации (A), синий для мокрого помола (B), зеленый для обработки ультразвуком (С). Частица структура должна напоминать то, что было замечено использование SEM. Мера бар равна 5,0 мкм во всех кадрах. Рисунок 5. Схема метода для тестирования эффективности антиретровирусной nanoART. Для того чтобы проверить способность nanoART подавлять вирусную репликацию МДМ должен быть первым получавших nanoART а затем контакт с ВИЧ-1 ADA. Как и в исследованиях АРТ релиз, МДМ загружаются с nanoART, а затем промывают, чтобы удалить все частицы, которые не были внутренним. NanoART груженый МДМ которые затем культивировали до 15 дней с одним средства обмена наполовину каждые два дня. За это время (как правило, в дни 1, 5, 10 и 15) МДМ сталкиваются с проблемой ВИЧ-1 ADA. После каждого вирусные клетки экспозиция культивировали в течение еще 10 дней для того, чтобы позволить инфекции прогресса. На 10-й день после заражения СМИ образцы собираются в РТ анализа и клетки фиксировали и окрашивали для антигена р24. Номера для nanoART лечение МДМ, инфицированных и неинфицированных, также культивируют в параллельном и проверены на наличие антигена р24 и РТ деятельности. Рисунок 6. Тестирование nanoART эффективность у ВИЧ-1-инфицированных МДМ по p24 окрашивания. Яркие образы поле (20x цель) RTV-NP лечение МДМ 10 дней после того, как сталкиваются с проблемой ВИЧ-1 ADA. Нет инфекции присутствовал, когда клетки были оспорены с virus1 день после nanoART лечение (); обратить внимание на наличие НП в цитоплазме большинства клеток (вставка указаны стрелками). Инфекция присутствовала, когда клетки подвергались воздействию вируса через 10 дней после nanoART лечения (B), хотя в гораздо меньшей степени, чем клетки, не обработанных с nanoART (D), записка поддерживается наличием НП в некоторых клетках (Б вставке показаны стрелками), но меньше, чем в 1-й день после nanoART лечения (вставка). Изображение клеток, которые не были ни лечения, ни с nanoART инфицированных (С); отметить отсутствие НП в цитоплазме клеток (C вставка). Изображение клеток, которые не обращались с nanoART но контакт с ВИЧ-1 ADA (D). VIDEO 1. Живая клетка конфокальной микроскопии бедных РТВ-NP поглощение МДМ. Флуоресцентная микроскопия МДМ помечены зеленым с Vybrant Дио клеточной маркировке решение и обрабатывают красный меченных RTV-NP. Один снимок был сделан через каждые 30 секунд в течение 4 час при 60x увеличением. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео VIDEO 2. Живая клетка конфокальной микроскопии успешного RTV-NP поглощение МДМ. Флуоресцентная микроскопия МДМ помечены зеленым с Vybrant Дио клеточной маркировке решение и обрабатывают красный меченных RTV-NP. Один снимок был сделан через каждые 30 секунд в течение 4 час при 60x увеличением. Нажмите здесь, чтобы посмотреть видео
