Nanoarte produzione 1. Fresatura NanoArt bagnato da NETZSCH Metodi MicroCer Pesare i cristalli di droga e tensioattivi vari che verranno utilizzati per rendere la nanoformulations utilizzando una bilancia analitica e mescolarle con buffer di 10 mm Hepes, pH 7,8 con un T-18 mixer Ultraturrax fino a completa dispersione. La percentuale del farmaco nella formulazione dovrebbe essere compreso tra 1 – 2%. Per la fresatura continua, verificare che il refrigeratore e il compressore è acceso. La pressione di uscita dovrebbe essere intorno ai 100 PSI prima di iniziare a mulino vostro campione. Accendere l'unità di controllo e ruotare il serbatoio di rettifica in modo che i mezzi di comunicazione di rettifica può essere caricato nel serbatoio. Aggiungere 50 ml di perline alla camera di macinazione attraverso un imbuto. Assicurarsi che non ci sono perle in fili o qualsiasi al di fuori della camera di macinazione per evitare perdite nella tenuta meccanica. Assicurarsi che l'O-ring è al suo posto sulla camera di macinazione. Selezionare un appropriato maglia dello schermo e utilizzare l'assembly appropriato coperchio e fissare il coperchio serrando i dadi. La dimensione delle maglie schermo deve essere almeno la metà delle dimensioni delle perle. Utilizzare una grande maglia dello schermo per evitare che il prodotto ostruisca il filtro durante la fresatura continua. Abbassare la camera di macinazione per renderlo orizzontale con la manopola fornito sulla parte superiore della camera e verificare che il prodotto si svuota presa tubo nel serbatoio di raccolta. Aggiungere la sospensione della droga con varie quantità di tensioattivi verso l'ingresso del prodotto. Il volume minimo della sospensione deve essere di 100 ml. Questo consentirà di evitare la camera di macinazione dal surriscaldamento ed evitare la contaminazione tallone a causa di una minore usura su parti Avviare la pompa con l'unità di controllo. La portata può essere variata come richiesto per la formulazione (~ 50 – 150 mL / min). Accendere l'agitatore e regolare la velocità sulla centralina. La velocità può essere aumentata da 620 rpm a 4320 rpm su un MicroCer. Monitorare la temperatura con l'indicatore della temperatura che è attaccato in alto sulla camera di macinazione e assicurarsi che non vi è surriscaldamento. Mill il campione a varie velocità e portate ed estrarre piccole aliquote (~ 1 mL) della formula per la misurazione delle dimensioni e la carica con una diffrazione della luce Scattering Brookhaven Zetasizer (Tabella 1). Dopo le dimensioni desiderate si ottiene, fermare la fresatura utilizzando l'unità di controllo. Con la pompa ancora, raccogliere il campione in un pallone. Lasciare che il farmaco per drenare completamente nel pallone di raccolta del campione. Spegnere la pompa. Per rimuovere le perline, posto un vassoio di raccolta sotto l'unità. Allentare i dadi sulla piastra anteriore del gruppo coperchio e raccogliere le perle nel cassetto. Togliere la placca frontale e usare una bottiglia di acqua deionizzata per lavare le perle nel cassetto. Trasferire la sospensione fresato in provette da 50 ml per centrifuga e impostare la centrifuga a 10.000 giri al minuto (10.174 RCF) per 30 minuti. Al termine del ciclo di centrifuga, misurare la quantità di surnatante e sostituire con la stessa quantità di soluzione di tensioattivo fresca. Una volta risospensione è completa, trasferire la sospensione alla camera di fresatura e mulino per 10 minuti. Prelevare un 'aliquota (~ 1 ml) e misurare le dimensioni e la carica del campione ancora una volta usando il Zetasizer (Tabella 1). Eseguire un post-uso pulizia del MicroCer con acqua deionizzata e il 70% di etanolo. Misurare la concentrazione delle formulazioni NanoArt utilizzando HPLC. Nel nostro caso, abbiamo valutato i campioni da HPLC in fase inversa utilizzando triplice copia 20 iniezioni microlitri su una colonna YMC ottile C8 (Waters Inc., Milford, MA) con una guardia C8 cartuccia. Fase mobile costituita da acetonitrile 48% / 52% 25mM KH 2 PO 4, pH 4,15 viene pompata a 0,4 mL / min con rilevazione UV / Vis a 272 nm. Per tutte le misure di droga, la quantificazione è determinata dal confronto con una curva standard di ogni farmaco libero (0,025-100 mg / ml) in metanolo. 2. Nanoarte omogeneizzazione con il Avestin EmulsiFlex C5 Misurare i cristalli di droga e tensioattivi vari che verranno utilizzati per rendere la nanoformulations utilizzando una bilancia analitica e mescolarle con tampone mm 10 Hepes, pH 7,8 con un T-18 mixer Ultraturrax di ottenere la dispersione completa. Trasferire la sospensione alla nave omogeneizzazione e iniziare a ricircolo. Assicurarsi che il chiller sia acceso prima di iniziare a omogeneizzare il campione Aumentare la pressione gradualmente fino a che l'indicatore dia 20.000 ± 2.000 psi e continuare a omogeneizzare fino a quando la dimensione delle particelle obiettivo è raggiunto. Questo richiede di solito tra i 45 – 60 minuti. Prelevare un 'aliquota (~ 1 ml) periodicamente e misurare le dimensioni e la carica del campione utilizzando un Zetasizer (Tabella 1). Trasferire la sospensione dalla omogeneizzatore omogeneizzato ai tubi da 50 ml per centrifuga e impostare la centrifuga a 10.000 giri al minuto (10.174 RCF) per 30 minuti. Al termine dellail ciclo di centrifuga, misurare la quantità di surnatante e sostituire con un uguale volume di soluzione di tensioattivo fresca. Dopo la risospensione, trasferire la sospensione per l'omogeneizzatore C5. Riavviare la circolazione e riportare la pressione omogeneizzante a 20.000 ± 2.000 psi e omogeneizzare per 30 minuti. Misurare le dimensioni e la carica della formulazione con il Zetasizer (Tabella 1). Effettuare la pulizia del posto di unità con acqua deionizzata e etanolo come solvente. Misurare la concentrazione dei campioni mediante HPLC. 3. Sonicazione utilizzando il processore Cole Parmer ultrasuoni Misura 50 mL di diclorometano in un bicchiere di vetro. Misura 6 g di poli (lattico-co-glicolico) (PLGA) utilizzando la bilancia analitica, aggiungere al diclorometano, e mescolare fino a completa dissoluzione si osserva. Misura 1,25 g di cristalli di droga e aggiungere al diclorometano / soluzione di PLGA. Mescolare per ottenere la completa dissoluzione. Fare 1% di alcol polivinilico (PVA) soluzione di tensioattivi e raffreddarlo con un bagno di ghiaccio. Assicurarsi che la soluzione tensioattivo sia freddo prima l'aggiunta della soluzione organica che contiene il farmaco disciolto. Versare la soluzione nel farmaco l'1% di soluzione di tensioattivo PVA e avviare il ultrasonicatore al 50% di ampiezza. Assicurarsi che la soluzione tensioattivo è posto in un bagno di ghiaccio. L'ampiezza della ultrasuoni può essere ridotta a ampiezza ~ 30% per i piccoli lotti di campioni. Sonicare il campione per 10 minuti. Estrarre una piccola aliquota (~ 1 ml) per l'analisi della dimensione delle particelle (Tabella 1). Se la dimensione delle particelle è maggiore di 1,5 micron, sonicare il campione a intervalli di 2 minuti fino ad un massimo di 16 minuti totali. Osservare i campioni al microscopio a 20x e osservazioni documento (Figura 1A). Utilizzare un piatto mescolate per creare un vortice adeguata per la sospensione rimanente e continuare a mescolare durante la notte a temperatura ambiente. Pesare 8 g di mannitolo in un pallone e aggiungere 80 ml di acqua RO. Mescolare fino a completa dissoluzione viene osservata e conservare a temperatura ambiente. Questo sarà utilizzato per la risospensione dopo centrifugazione se i campioni devono essere liofilizzato. Raccogliere la sospensione dopo 24 ore e versare in provette da 50 ml per centrifuga. Centrifugare i campioni ad una velocità di 8.000 rpm per 20 minuti a 5 ° C. Decantare il surnatante e risospendere la metà del campione in 75 ml di osmosi inversa filtrata (RO) l'acqua e l'altra metà in 75 ml di 0,5% bromuro trimetilammonio cetilico (CTAB) tensioattivo. Centrifugare i campioni di nuovo ad una velocità di 8.000 rpm per 20 minuti a 5 ° C e risospendere ciascuno dei pellet con un totale di 20 mL di soluzione di mannitolo. Dopo la risospensione secondo, misurare le dimensioni delle particelle utilizzando il Zetasizer (Tabella 1). Utilizzare fiale idonei a trasferire la sospensione rimanente e metterli in liofilizzatore. Misura della concentrazione del campione utilizzando HPLC. 4. Nanoarte Morfologia Prendere sospensione NanoArt e brevemente sonicare al 20% di ampiezza per 5 secondi con una sonda sonicazione. Trasferire 10 ml di sospensione in 1,5 ml di acqua RO all'interno di un tubo da microcentrifuga 1,7 ml e vortex per 10 secondi. Prendete un campione di 50 ml di acqua-NanoArt soluzione e trasferirli in un apparato di filtrazione costituito da un supporto in polipropilene 13 Swinnex filtro assemblato con un 0,2 micron di filtrazione a membrana in policarbonato (Nuclepore Track-inciso). L'apparato di filtrazione è innescato con 50 microlitri 0.2μm acqua distillata filtrata prima dell'aggiunta della sospensione farmaco diluito. Vuoto viene poi applicata agli apparecchi fino a quando il volume intera soluzione è stata completamente tirata oltre la filtrazione a membrana. Una volta che la membrana è asciutto, è apposto su un perno in alluminio con doppio perno nastro di carbonio conduttivo bastone e polverizzazione rivestito con palladio. Lo stub campione viene poi ripreso utilizzando, nel nostro caso, un JEOL JSM6300F bassa tensione, di emissione di campo microscopio elettronico a scansione (Figura 2). 5. Nanoarte visualizzazione Prendere le sospensioni NanoArt preparati e ultrasuoni per 10 secondi al 20% di ampiezza con una sonda sonicazione. Prendete un vetrino da microscopio copertura antiscivolo e posizionarlo su un microscopio invertito. Sul vetrino Mescolare 15 ml di sospensione NanoArt con 100 l di tampone fosfato (PBS) e mescolare pipettando su e giù parecchie volte. Visualizza le nanoparticelle con un obiettivo 20x (Figura 3). Biologia della Nanoarte 6. Isolamento e preparazione di sangue monociti e macrofagi Borne derivate da monociti (MDM) Ottenere monociti umani da parte leucaferesi da HIV-1 e donatori sieronegativi epatite e purificare le cellule controcorrente elutriation centrifuga. Valutare la purezza delle cellule da immunomarcatura con anti-CD68 (clone KP-1) Dal Wright macchiato cytospins 1. Monociti cultura purificati in DMEM supplementato con 10% di siero pool di siero umano, 1% glutamina, 50 mg / ml di gentamicina, 10 mg / ml ciprofloxacina e 1000 U / mL ricombinante umano fattore stimolante colonie di macrofagi (MCSF) ad una concentrazione di 1×10 6 cellule / ml a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO 2. Piastra 2×10 6 cellule per pozzetto in piastre da 6 celle bene e cultura per 7 giorni al fine di permettere a differenziarsi in monociti macrofagi 1. (Figura 3A) 7. Assorbimento delle cellule e la Collezione Mescolare NanoArt con terreni di coltura (senza MCSF) ad una concentrazione finale di 100 mM e aggiungere 1 ml di terreno di trattamento in ciascun pozzetto. Al punto desiderato tempo, o quando le cellule sono a pieno carico con NanoArt (Figura 2), rimuovere tutte le terreno di trattamento e lavare le cellule 3 volte con 1 ml di PBS per rimuovere eventuali particelle che non sono stati presi in dalle cellule. In 1 ml di PBS, rimuovere cellule aderenti dal fondo del pozzo utilizzando un sollevatore di cellulare e metterli in una provetta da microcentrifuga 1,7 ml 2-4. Centrifugare le cellule a 1.000 rcf a 4 ° C per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungere 200 ml di metanolo 100%. Lisare le cellule e si dissolvono NanoArt con una breve (2-5 secondi) sonicating il pellet con una sonda sonicating al 20% di ampiezza. Conservare i campioni a -80 ° C fino al momento di analizzare il contenuto di droga. 8. Ritenzione intracellulare di Nanoarte Trattare MDM, come descritto nel paragrafo 7.1. Al punto di tempo desiderato, lavare le cellule, come descritto in 7.2; ma invece di raschiare subito fino cellule, fissare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente in una soluzione del 3% glutaraldeide in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4) e ulteriormente fissare per 10 minuti con tetrossido di osmio 1% in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4). Rimuovere fissativo e raschiare le cellule in 1 ml di PBS come descritto in 7.2. Inoltre, raccogliere e centrifugare cellule, come descritto in 7.2; ma invece di aggiungere metanolo al pellet, aggiungere 200 microlitri della soluzione del fissativo glutaraldeide. Tagliare pellet cellulare in sottili (80 nm) sezioni con un microtomo. Macchiare le sezioni con acetato di uranile e citrato di piombo. Osservare le sezioni colorate usando la microscopia elettronica a trasmissione (Figura 4). 9. ARTE rilascio Curare le cellule, come descritto nella 7,1-7,2, tuttavia, invece di raccogliere le cellule dopo il lavaggio, sostituire PBS con 2 ml di terreno di coltura cellulare senza MCSF e senza NanoArt. Nei giorni indicati, o come indicato dal terreno di coltura di svolta giallo, mezzo di scambio del mezzo. Al giorno desiderato, di raccogliere 1 mL del mezzo di cellule con le cellule si riproducono, come descritto nella 7,2-7,3. Celle di processo, come indicato al punto 7.3. Fluido di processo con l'aggiunta di 150 ml di campione medio di 1 ml di metanolo 100% e vortice a pieno regime per 10 secondi. Centrifugare i campioni a 21.000 rcf per 10 minuti. Rimuovere il supernatante e trasferirlo in una nuova provetta. Evaporare il metanolo con una centrifuga a vuoto, questo può richiedere da 1 a 4 ore a seconda del campione. Conservare i campioni a -80 ° C fino al momento per l'analisi della droga. 10. In tempo reale assorbimento di Nanoarte di microscopia confocale Prendere MDM maturo dal punto 6.2 e etichetta le cellule con una soluzione di etichettatura delle cellule, come soluzione Vybrant Etichettatura cella seguenti istruzioni del produttore. Lavare le cellule 3 volte con 1 ml di terreno di coltura per rimuovere il colorante in eccesso. Mescolare NanoArt con terreno di coltura come al punto 7.1 con NanoArt fluorescente. Aggiungi terreno di trattamento con NanoArt etichettati immediatamente prima di imaging con un microscopio confocale. Scattare una foto ogni 30 secondi per 4 ore con un obiettivo 60x 5 (Video 1 e 2). Infezione da HIV-1 e saggi Infettività 11. HIV-1 ADA Infezione Curare le cellule, come descritto nella 9,1-9,3. Nei giorni desiderato, rimuovere tutti i media e sostituirlo con il mezzo, senza MCSF, contenenti HIV-1 ADA a una molteplicità di infezione di 0,01 particelle virali / cellule e incubare per 24 ore 1. Rimuovere media virali e sostituirlo con fresco, senza virus media. Celle di coltura per 10 giorni lo scambio di metà della media a giorni alterni o come necessario per mantenere le cellule vive (Figura 5) 6. Dieci giorni dopo l'infezione raccogliere 10 ml di medium di ogni bene, posto in una piastra da 96 pozzetti, e conservare a -80 ° C fino al momento di eseguire retrovirali (indietro) analisi della trascrittasi. 12. Trascrittasi inversa (RT) Assay Con ogni campione di 10 L a partire dal punto 11.3, miscelare 10 ml di una soluzione che contiene 100 mM Tris-HCl (pH 7,9), 300 mM KCl, 10 mM DTT, 0.1% nonil phenoxylpolyethoxylethanol-40 (NP-40), e l'acqua. Incubare questa miscela per 15 minuti a 37 ° C 7. <l i> Aggiungere 25 ml di una soluzione contenente 50 mM Tris-HCl (pH 7,9), 150 mM KCl, 5 mM DTT, 15 mM MgCl 2, 0,05% NP-40, 10 mg / ml poli (A), 0,250 U / mL oligo d (T) 12-18, e 10 μCi / mL 3 H-TTP in ciascun pozzetto e incubare a 37 ° C per 18 ore 7. Dopo l'incubazione, aggiungere 50 ml di acido ghiacciato 10% tricloroacetico (TCA) in ciascun pozzetto. Raccolta dei pozzi su filtri in fibra di vetro, e valutare i filtri per 3 H-TTP incorporazione da β-scintillazione spettroscopia 7. 13. HIV-1p24 rilevamenti Lavare le cellule replicano da cui è stato rimosso retrovirali campione medio della trascrittasi al passo 11,3 con il risciacquo con 1 ml di PBS 3 volte. Fissare le cellule con paraformaldeide 4% durante la notte a 4 ° C. La mattina seguente lavare le cellule 3 volte con PBS. Utilizzare gli anticorpi monoclonali murini di HIV-1 p24 (1:10, Dako, Carpinteria, CA) per visualizzare l'infezione da HIV. Celle di immagine in campo chiaro utilizzando un obiettivo 40x (Figura 6). 14. Rappresentante dei risultati: Droga Dimensione (Nm) PDI Carica (Mv) Tensioattivi IDV 1052 0,286 -24,58 P188 lo 0,5%, 5,0% SDS, saccarosio 9,25% RTV 233 0,273 -7,47 P188 lo 0,5%, 9,25% di saccarosio ATZ 840 0,192 25,47 P188 lo 0,5%, 0,1% mPEG 2000-DSPE, DOTAP 1,0%, 9,25% di saccarosio EFV 347 0,235 -13,52 1,0% PVA Caratteristiche Tabella 1. Fisiche di Nanoarte La tabella mostra i valori rappresentativi potenziale per le caratteristiche fisiche di formulazioni NanoArt realizzati con i tensioattivi indicato. Valori comprendono il diametro medio in base alla intensità della luce diffusa, l'indice polidispersità (PDI, una stima della distribuzione delle dimensioni delle particelle) e il potenziale zeta valori ottenuti per i campioni nanoformulation vari. Abbreviazioni utilizzate nella tabella: IDV: indinavir; RTV: ritonavir; ATV: atazanavir; EFV: effavirenz; PVA: polivinilalcool; SDS dodecil solfato di sodio; P188: poloxamer 188 (detta anche Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: metil-poli (glicole etilenico) 1,2-distearoyl-fosfatidil-etanolammina; DOTAP: (1-oleoyl-2-[6 – [(7-nitro-2-1 ,3-benzoxadiazol-4-il) ammino] Hexanoyl] – 3-trimetilammonio propano. FIGURA 1. Diagramma di flusso che riassume i vari metodi utilizzati per la fabbricazione NanoArt. La figura 1 riassume i vari metodi utilizzati per la fabbricazione NanoArt. Il diagramma di flusso include un anticipato tempo-allotment per ognuna delle fasi critiche dei rispettivi metodi. FIGURA 2. Immagini rappresentative della morfologia NanoArt desiderabili e indesiderabili. Analisi di microscopia elettronica a scansione (ingrandimento, 15.000 X) di RTV NanoArt prodotto da omogeneizzazione, macinazione ad umido, e sonicazione sulla cima di un 0,2 micron di filtrazione a membrana in policarbonato. Barra di misura è uguale a 2,0 micron di tutti i fotogrammi. Nanoarte auspicabile consistono, in media, di piccoli (≤ 2 micron) self-contained particelle con bordi lisci che tendono ad avere la stessa forma o simili. Nanoarte indesiderati variano molto per dimensioni e forma e possono fondersi e / o un bastone l'uno all'altro. FIGURA 3. Immagini di soluzione NanoArt desiderabile e di MDM occupare NanoArt. Le immagini luminose microscopia a campo (tutti acquisiti utilizzando un obiettivo 20x) di omogeneizzato RTV-NP e MDM prendendo NanoArt. Dopo combinare dispositivi a 10 ml di RTV-NP soluzione con 100 ml di PBS sulla cima di una scivolata copertura in vetro, le particelle sono visibili e assomigliano sabbia con solo alcune delle particelle più grandi sia singolarmente identificabili (A). Immagine di completamente differenziate e MDM fuso a forma di prima NanoArt trattamento (B). Dopo che le cellule hanno preso Nanoarte, diventano più scure e loro nuclei diventano più evidenti a causa della distribuzione perinucleare della Nanoarte, tuttavia, ancora mantenere il loro corpo cellulare a forma di fuso (C). Una volta che le cellule diventano sovraccarico di Nanoarte, i nuclei oscurata, e le cellule diventano arrotondati, perdendo la loro struttura a forma di fuso e potenzialmente distacco dal fondo del pozzo (D). 4 "/> FIGURA 4. Conferma di incorporazione cellulare del NanoArt in MDM. Microscopia elettronica a trasmissione (ingrandimento, 15.000 x) dimostra assorbimento di Nanoarte in MDM esposti a RTV-NP da omogeneizzazione (A), RTV-NP da molitura ad umido (B), RTV-NP da sonicazione (C), e le cellule non trattate (D ). All'interno delle cellule, il NanoArt devono essere facilmente identificabili per la loro forma geometrica. Si noti la mancanza di strutture geometriche evidenti nella cella di controllo (D). Un esempio di ogni particella è stato delineato: rosso per omogeneizzazione (A), blu per la molitura ad umido (B), verde per sonicazione (C). Struttura delle particelle dovrebbe essere simile a quello che è stato visto con SEM. Barra di misura è uguale a 5,0 micron di tutti i fotogrammi. FIGURA 5. Schema del metodo per testare l'efficacia antiretrovirale di Nanoarte. Al fine di testare la capacità di Nanoarte MDM di inibire la replicazione virale devono essere trattati in prima con NanoArt e quindi esposti al virus HIV-1 ADA. Simile a studi rilasciare il ARTE, MDM sono caricati con NanoArt e poi lavata per rimuovere eventuali particelle che non sono stati interiorizzati. Nanoarte carico MDM vengono poi coltivate fino a 15 giorni con uno scambio mezzo di media a giorni alterni. Durante questo periodo (in genere nei giorni 1, 5, 10, e 15) MDM sono sfidati con HIV-1 ADA. Dopo ogni esposizione virale cellule sono coltivate per altri 10 giorni per consentire l'infezione al progresso. Il giorno 10 dopo l'infezione campioni media sono raccolti per l'analisi RT e le cellule fissate e colorate per l'antigene p24. Non NanoArt MDM trattati, sia infetti e non infetti, sono anche coltivate in parallelo e testato per la presenza di antigene p24 e di attività RT. FIGURA 6. Test di efficacia NanoArt di HIV-1 MDM infettato da colorazione p24. Immagini in campo chiaro (obiettivo 20x) di RTV-NP trattati MDM 10 giorni dopo la messa in discussione con l'HIV-1 ADA. Nessuna infezione era presente quando le cellule si sono sfidati con virus1 NanoArt giorni post-trattamento (A); notare la presenza di NP all'interno del citoplasma della maggior parte delle cellule (Un inserto indicato dalle frecce). L'infezione era presente quando le cellule sono state esposte al virus 10 giorni dopo il trattamento NanoArt (B), anche se molto meno rispetto alle cellule non trattate con NanoArt (D); notare la presenza di NP mantenuto in alcune cellule (riquadro B indicato dalle frecce), ma meno al giorno 1 NanoArt post-trattamento (A riquadro). Immagine di cellule che non erano né trattati con NanoArt né infetti (C); mancanza nota di NP nel citoplasma della cellula (C riquadro). Immagine di cellule che non sono stati trattati con NanoArt ma esposti al virus HIV-1 ADA (D). VIDEO 1. Live microscopia confocale cellula del povero RTV-NP assorbimento da MDM. Microscopia a fluorescenza di MDM etichettati verde con Vybrant Dio cellule soluzione di etichettatura e trattati con il rosso marcato RTV-NP. Un immagine è stata scattata ogni 30 secondi per 4 ore con ingrandimento 60x. Clicca qui per guardare il video VIDEO 2. Live microscopia confocale cellula del successo RTV-NP assorbimento da MDM. Microscopia a fluorescenza di MDM etichettati verde con Vybrant Dio cellule soluzione di etichettatura e trattati con il rosso marcato RTV-NP. Un immagine è stata scattata ogni 30 secondi per 4 ore con ingrandimento 60x. Clicca qui per guardare il video
