Imágenes en tiempo real de los leucotrienos B 4 La migración mediada por células y BLT1 interacciones con β-arrestina
Özet
Este trabajo describe la metodología para determinar la respuesta quimiotáctica de los leucocitos a ligandos específicos e identificar las interacciones entre los receptores de superficie celular y proteínas citosólicas utilizando técnicas de imagen en vivo de la célula.
Abstract
Receptores acoplados a proteína G (GPCR) pertenecen a la familia de proteínas transmembrana siete y mediar en la transducción de señales extracelulares de respuestas intracelulares. GPCRs control de diversas funciones biológicas como la quimiotaxis, la liberación de calcio intracelular, regulación de los genes de una manera dependiente de ligando a través de heterotrimeric proteínas G 1-2. Unión del ligando induce una serie de cambios conformacionales que conducen a la activación de heterotrimeric G-proteínas que modulan los niveles de segundos mensajeros como el monofosfato de adenosina cíclico (cAMP), inositol trifosfato (IP3) y glicerol diacil (DG). Concomitante con la activación de la unión del ligando del receptor también inicia una serie de eventos para atenuar la señalización del receptor a través de la desensibilización, el secuestro y / o internalización. El proceso de desensibilización de GPCRs se produce a través de la fosforilación de los receptores de las quinasas del receptor de la proteína G (GRKs) y posterior unión de β-arrestins 3. β-arrestins son proteínas citosólicas y trasladar a la membrana de la activación de GPCR, la unión a receptores fosforilados (la mayoría de los casos) que, al facilitar la internalización del receptor 6.4.
Leucotrieno B 4 (LTB 4) es una molécula pro-inflamatoria lípidos derivados del ácido araquidónico vía y media sus acciones a través de GPCRs, LTB 4 receptor 1 (BLT1, un receptor de alta afinidad) y LTB 4 receptor 2 (BLT2, un receptor de baja afinidad ) 7-9. El LTB 4 BLT1 vía ha demostrado ser crucial en varias enfermedades inflamatorias, entre ellas, el asma, la artritis y la aterosclerosis 10-17. El presente documento describe las metodologías desarrolladas para controlar LTB 4-inducida por la migración de leucocitos y las interacciones de BLT1 con β-arrestina y translocación de los receptores en las células vivas mediante técnicas de microscopía 18-19.
La médula ósea procedentes de células dendríticas de ratones C57BL / 6 fueron aisladas y cultivadas como se describió anteriormente 20-21. Estas células se pusieron a prueba en vivo de imágenes de células métodos para demostrar LTB 4 migración celular inducida. El BLT1 humanos fue etiquetado con la proteína roja fluorescente (RFP BLT1-) en el C-terminal y β-arrestin1 etiquetados con una proteína fluorescente verde (β-arr-GFP) y se transfectaron los plásmidos, tanto en rata basófilos Leukomia (RBL-2H3) las líneas celulares 18-19. La cinética de la interacción entre estas proteínas y la localización se controlaron mediante microscopía de vídeo en directo de la célula. Las metodologías en el presente documento describe el uso de técnicas de microscopía para investigar las respuestas funcionales de los receptores de la proteína G de acoplamiento en las células vivas. El presente documento también describe el uso de software Metamorph para cuantificar la intensidad de fluorescencia para determinar la cinética de los receptores y las interacciones de las proteínas citosólicas.
Protocol
Discussion
Imágenes de células vivas es una poderosa herramienta para demostrar la función y las interacciones de las proteínas específicas que se producen en tiempo real. Los métodos descritos en este manuscrito muestra claramente que LTB 4 puede inducir una rápida migración de las células dendríticas. Estos métodos no sólo ampliar los aspectos de LTB 4 en función de diversos tipos de células, que permiten a los mismos métodos que se aplican a una variedad de otras quimiocinas y pruebas de su …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación es apoyada por los Institutos Nacionales de Salud subvenciones AI-52 381, CA138623 y Kentucky, el cáncer de pulmón Junta de Investigaciones y el apoyo institucional de James Graham Brown Cancer Center.
Materials
| Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell lines: | ||||
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | ||
| Media: | ||||
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | ||
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | ||
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | ||
| Others: | ||||
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | WPI | FD35-100 | ||
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | ||
| Instruments/software: | ||||
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | |||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging | |||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | |||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | |||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | |||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | |||
| cDNA constructs: | ||||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | |||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
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