Özet

בזמן אמת הדמיה של leukotriene B 4 Cell Migration מתווכת ו BLT1 אינטראקציות עם β-arrestin

Published: December 23, 2010
doi:

Özet

מאמר זה מתאר את המתודולוגיה כדי לקבוע את התגובה chemotactic של לויקוציטים אל ligands ספציפיים לזהות אינטראקציות בין משטח קולטני התא וחלבונים cytosolic באמצעות טכניקות הדמיה תא חי.

Abstract

קולטני G-חלבון בשילוב (GPCRs) שייכים למשפחת seven חלבון הטרנסממברני ולתווך התמרה של אותות תאיים לתגובות תאיים. GPCRs לשלוט תפקודים ביולוגיים מגוונים כגון chemotaxis, שחרור סידן תוך תאי, ויסות הגנים באופן ליגנד תלוי דרך heterotrimeric G-חלבונים 1-2. ליגנד גורם מחייב סדרה של שינויים קונפורמציה המוביל heterotrimeric ההפעלה של ה-G-חלבונים לווסת את רמות שליחים second כגון monophosphate מחזורי אדנוזין (cAMP), אינוסיטול טריפוספט (IP3) וגליצרול diacyl (DG). בד בבד עם הפעלת הכריכה ליגנד לקולטן גם יוזם סדרה של אירועים, כדי לרכך את הקולטן איתות באמצעות קיבוע הפחתת רגישות, ו / או הפנמה. תהליך הפחתת רגישות של GPCRs מתרחשת באמצעות זירחון רצפטור על ידי G-חלבון קולטן קינאז (GRKs) ומחייבת הבאות של β-arrestins 3. β-arrestins הם חלבונים cytosolic ו translocate קרום על הפעלת GPCR, קשירה לקולטנים פוספורילציה (ברוב המקרים) לשם הקלת הפנמה קולטן 4-6.

Leukotriene B 4 (LTB 4) הוא מולקולה הפרו דלקתי שומנים שמקורם מסלול חומצה arachidonic ומתווך פעולותיה באמצעות GPCRs, LTB 4 קולטן 1 (BLT1; קולטן זיקה גבוהה) ו LTB 4 קולטן 2 (BLT2; קולטן זיקה נמוכה ) 7-9. מסלול 4-BLT1 LTB הוכח להיות קריטי מספר מחלות דלקתיות, כולל דלקת מפרקים אסטמה, טרשת עורקים 10-17. המאמר הנוכחי מתאר את מתודולוגיות שפותחו כדי לפקח LTB 4-Induced הגירה ליקוציט ואת האינטראקציות של BLT1 עם β-arrestin ו, טרנסלוקציה קולטן בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ טכניקות הדמיה 18-19.

מוח העצם נגזר מן התאים הדנדריטים C57BL / 6 עכברים בודדו בתרבית כפי שתואר לעיל 20-21. תאים אלו נבדקו שיטות הדמיה לחיות תא להפגין LTB 4 הגירה המושרה תא. BLT1 האדם היה מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי אדום (BLT1-RFP) בתחנה הסופית-C ו-β-arrestin1 מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (β-arr-GFP) ו transfected הן פלסמידים לתוך עכברוש Basophilic Leukomia (RBL-2H3) שורות תאים 18-19. קינטיקה של האינטראקציה בין החלבונים האלה ולוקליזציה נוטרו באמצעות מיקרוסקופ וידאו חי התא. מתודולוגיות במאמר הנוכחי מתארים את השימוש בטכניקות מיקרוסקופיות לחקור את התגובות תפקודית של G-חלבון קולטנים יחד בתאים חיים. המאמר הנוכחי מתאר גם את השימוש Metamorph התוכנה לכמת את עוצמות הקרינה כדי לקבוע את הקינטיקה של הקולטן אינטראקציות חלבון cytosolic.

Protocol

מתודולוגיה תיאור של מיקרוסקופ חיים הדמיה ניסויים תא שבוצעו באמצעות TE-FM Epi-Fluorescence המערכת מחוברת מיקרוסקופ Nikon הפוך Eclipse TE300. מיקרוסקופ המצויד בשלב החימום. הצמד מגניב HQ דיגיטלי B / W CCD (רופר מדעי) המצ?…

Discussion

הדמיה תא חי הוא כלי רב עוצמה כדי להדגים את הפונקציה ואת האינטראקציות של חלבונים מסוימים כפי שהם מתרחשים בזמן אמת. השיטות שתוארו בכתב היד הזה מראים בבירור כי LTB 4 יכול לגרום להגירה מהירה של תאים דנדריטים. שיטות אלה לא רק להרחיב את ההיבטים של פונקציה 4 LTB לסוגי…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AI-52381, CA138623 וקנטקי לחקר סרטן הריאות פורום תמיכה מוסדית של ג'יימס גרהאם בראון Cancer Center.

Materials

Material Name Tip Company Catalogue Number Comment
Cell lines:        
Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells.   ATCC CRL-2256  
Media:        
Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM)   Invitrogen 11995  
Phenol red free RPMI or DMEM   Invitrogen 11835-030  
Fetal Bovine Serum   Invitrogen 16000-044  
L-Glutamine (200 mM)   Invitrogen 25030  
Penicillin-streptomycin (10000 U/mL)   Invitrogen 15140  
Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid   Invitrogen 25300  
HEPES (1M)   Invitrogen 15630  
Others:        
35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish)   WPI FD35-100  
Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad)   Bio-Rad 16552088  
Instruments/software:        
Gene Pulser II electroporater   Bio-Rad    
TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300   Nikon    
Metamorph Software   Universal Imaging    
Vertical Micro-pipette puller   Narishige International    
Micro-Forge M-900   Narishige International    
Hadraulic Micromanipulator MO-188NE   Narishige International    
Coarse Manual Manipulator, MN-188NE   Narishige International    
cDNA constructs:        
cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP)   Jala et al 2005    
cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study).   Jala et al 2005    

Referanslar

  1. Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
  2. Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
  3. Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
  4. Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
  5. Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
  6. . Beta-arrest or. Nature. 383, 447-450 (1996).
  7. Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
  8. Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
  9. Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. Leukotriene B4 receptors. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).
  10. Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
  11. Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
  12. Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
  13. Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
  14. Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
  15. Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
  16. Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
  17. Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
  18. Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
  19. Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
  20. Del Prete, A., A, . Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
  21. Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
  22. Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with β-arrestin. J. Vis. Exp. (46), e2315, doi:10.3791/2315 (2010).

View Video