Stimare i tassi di produzione del virus nei sistemi acquatici

1. Ultrafiltrazione di acqua di mare per generare acqua "virus-free" (Wilhelm & Poorvin 2001) Circa 20L di acqua di mare / lakewater è raccolto come in modo asettico possibile. L'acqua è in serie prefiltrata attraverso 142-mm di diametro filtri di policarbonato 0,8 micron, che possono essere conservati a -20 ° C per l'analisi della comunità. Filtri più grandi dimensioni dei pori possono essere utilizzati prima di questo passaggio per sistemi molto produttivo. Per ottenere acqua ultrafiltrato da un sistema M12 Amicon (Millipore) viene utilizzato un cut-off 30 kDa-cartuccia spirale di escludere tutti i virus, anche piccolo virus RNA. I campioni vengono processati e concentrati a velocità ~ 25% ~ 15-16 kPa di contropressione. Il campione rimanente di circa 500 ml di acqua conterrà una comunità concentrata virus (che può essere salvato per altri esperimenti), mentre il restante 19,5 L di virus acqua verrà utilizzata per le prove di produzione virale. Dopo ogni giorno di utilizzo, il Amicon M12 sistema deve essere pulito per evitare di danneggiare la membrana del filtro a cartuccia. Se si lavora con acqua di mare, lavare la membrana con almeno 6L di Milli-Q acqua seguita da un lavaggio con soluzione di NaOH 0.1N per 30-45 minuti. Anche in questo caso lavare la cartuccia con almeno 6L di acqua Milli-Q. Al termine usando il sistema di M12, la cartuccia a spirale deve essere conservato in un 0.05MH 3 PO 4 soluzione a 4 ° C. 2. Virus Metodo di riduzione per la produzione virale (Wilhelm et al. 2002) Fino a 500 ml di acqua di mare / lakewater campione sia con ospite e virus si ottiene e posto in una unità sterifilter con un 0,2 micron nominale dei pori di dimensioni a basso legame proteico filtro (ad esempio, Durapore) posto su di esso. Il campione viene delicatamente vuoto sotto pressione a <200 mmHg, mentre continuamente risospendere il campione usando una pipetta sterile trasferimento di inibire le cellule batteriche di concentrarsi sul filtro. Lentamente tre volumi di ultrafiltrato si aggiungono alla sospensione batterica per ridurre significativamente il numero di virus libero nel campione. La frazione batterica viene diluito torna a 500 ml con acqua priva di virus e divisa in tre repliche da 150 ml ciascuno e sono collocati in chiaro 250ml bottiglie in policarbonato. 3. Portata di filtrazione tangenziale (TFF) Metodo di produzione virale (Weinbauer et al. 2002, Winget et al. 2005) TFF rappresenta un approccio alternativo al metodo di riduzione virale. Circa 500 ml di campione naturale viene raccolto come sopra descritto. Questo esempio è concentrata con un 0,2 micron nominale dei pori di dimensioni tangenziale sistema di filtraggio del flusso. Quando la frazione batterica è ridotta a circa 10-15 ml, ultrafiltrato, senza virus viene aggiunta acqua e distribuito come sopra. Le bottiglie vengono incubate a replicare in situ utilizzando camere ambientali. I livelli di luce sono alterati alle condizioni della superficie utilizzando azzurrata acrilico acrilico o deselezionare con lo screening rete per diminuire l'intensità della luce. Temperature di superficie ambiente sono spesso ottenute utilizzando un mazzo di acqua di mare che scorre incubatrice. I campioni per la stima dell'abbondanza batteriche e virali vengono prese al tempo 0, con una concentrazione finale di 2,0-2,5% glutaraldeide sterile aggiunto in cryovials. Questi campioni sono immediatamente istantaneamente congelati con l'azoto liquido e conservati congelati fino elaborati. Se l'azoto liquido non è disponibile, diapositive microscopia possono essere preparati e trasformati immediatamente (vedere la procedura di seguito) Sottocampioni sono raccolti ogni 2,5 ore per almeno 10 ore con il metodo sopra descritto. In questo momento l'acqua possono essere raccolti per l'analisi PCR quantitativa. Fino a 5 ml del campione può essere aggiunto a una provetta Microbank ™ con nessun agente fissativo con il congelamento immediato il flash in azoto liquido. 4. Produzione Microscopia virale (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al. 2004) Campioni congelati da 0.02-micron filtrata per microscopia devono essere scongelati su ghiaccio. Preparare una soluzione stock di SYBR Green diluendo la soluzione stock 1:10 con acqua sterile. Successivamente, dalla soluzione madre, preparare una soluzione di lavoro con l'aggiunta di 1 ml di soluzione madre a 39 ml di acqua sterile. Un glicerolo 50%, 50% di soluzioni tampone fosfato salino (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) e fresco soluzione madre al 2,5% del p-fenilendiammina dovrebbe anche essere preparato prima di iniziare. Tenere il glycerol/50% 50% soluzione di PBS a 4 ° C e il p-phenylenediammagazzino ine a -20 ° C al buio fino a quando partire. A destra prima di filtrare aggiungere il p-fenilendiammina alla PBS 50% glycerol/50% ad una concentrazione finale del 0,1% per essere utilizzato come soluzione Antifade. Mettere un 25 millimetri 0.02-micron filtro Anodisc sulla cima di un 0.45-micron MicronStep, filtro di supporto cellulosico. Aggiungere 850 ml di campione fissato alla parte superiore del Anodisc e vuoto a 20 pKa fino a completa essiccazione. Mettere 100 ml di soluzione SYBR Green lavorando ad una piastra di Petri sterile e, con il vuoto ancora, rimuovere con attenzione il Anodisc dalla torre di filtro e luogo on the Green SYBR. Incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per 20 minuti. Rimuovere con cautela il filtro dalla soluzione SYBR Green e stoppino sul retro del filtro con un Kimwipe per rimuovere tutti i residui di colorante. Se lo si desidera, ritorno il filtro alla torre e passare fino a 800 ml di 0.02-micron acqua filtrata o supporti sterile attraverso il filtro a sciacquare via macchia in eccesso. Aggiungere una piccola goccia di soluzione Antifade di un vetrino da microscopio e luogo uno slittamento di copertura sulla parte superiore. Rimuovere la lista di coperchio e aggiungere il filtro essiccato al vetrino da microscopio bagnato con la soluzione Antifade. Ancora una volta, aggiungere una piccola quantità di soluzione Antifade al vetrino e lentamente posto sulla parte superiore del filtro, avendo cura di eliminare eventuali bolle che si possono formare. Immediatamente congelare i campioni a -20 ° C fino al momento (che dovranno essere utilizzati entro pochi mesi per prevenire lo scolorimento e abbassato conta virus) I virus sono enumerati utilizzando la microscopia a fluorescenza (nel nostro caso un microscopio Leica DMRXA), con un ampio set di filtro blu (λ = Ex 450-490 nm, Em λ = 510 nm con un filtro di soppressione a λ = 510 nm). Ogni filtro avrà almeno 20 campi di vista contati, facendo attenzione a quantificare virus totale da ogni griglia campo per garantire un'equa distribuzione dei virus attraverso la membrana del filtro. I tassi medi di ripetersi virus da tre indipendenti replica vengono poi calcolati e una deviazione standard è determinato dai tassi di produzione. 5. Rappresentante Risultati I dati grezzi raccolti dal ricercatore richiede un numero minimo di elaborazione matematica per generare tassi di ricorrenza di abbondanza virus. Il set di dati primari risultante da questo studio è il tasso di ricorrenza di abbondanza virus nel sottocampioni dal incubazioni. Questi i risultati del modulo regressioni indipendente dal tempo contro virus abbondanza per ognuno dei campioni. Per ogni campione le incubazioni individuo agisce in un unico trattamento, in modo da replicare completando tre-incubazioni il ricercatore in grado di calcolare i tassi così come una stima della variazione (ad esempio, la deviazione standard) (vedi Figura 1). Un avvertimento di questo processo è che la riduzione invariabile virus abbondanza porta ad una riduzione della cellule ospiti nel campione che portano il peso del virus. Per compensare questa perdita, enumerazione di abbondanza batterica sia dalla sorgente (acqua di mare filtrata o di lago) e la T = 0 campione di incubazione sono necessari. Queste informazioni possono essere utilizzate per tenere conto della percentuale di cellule perse: ipotizzando che il processo di riduzione abbondanza virus non è selettiva a favore o contro qualsiasi membro della comunità microbica, questo fattore può quindi essere utilizzata per stimare il tasso di produzione in loco di virus . Figura 1. La produzione di campioni particelle virus-simili nel corso di un incubazione di 10 ore in condizioni in situ tramite microscopia in epifluorescenza. Sono stati raccolti nel corso di una fioritura di fitoplancton al largo della costa della Nuova Zelanda, nel settembre del 2008. Figura 2. Schema del processo di flusso di lavoro per analizzare la produzione di virus. Il processo inizia con l'ultrafiltrazione di acqua campione di generare virus acqua. Questo è completato con un sistema di ultrafiltrazione. Nei campioni di acqua parallelo sono raccolti dal sito stesso e il virus liberi passare attraverso un filtro, mentre la comunità microbica (contenente una miscela di cellule infette e non infette) viene mantenuto. Questa comunità è poi risospeso in acqua privo di virus e incubate in condizioni in situ. Il tasso di ricomparsa del virus viene poi monitorato per le prossime 10 ore per determinare il tasso di produzione di virus.