Het schatten van Virus Productie tarieven in aquatische systemen

1. Ultrafiltratie van zeewater aan "Virus-vrij" Water (Wilhelm & Poorvin 2001) Genereer Ongeveer 20L van zeewater / lakewater is zo aseptisch verzameld als mogelijk te maken. Water is serieel prefiltered door middel van 142-mm polycarbonaat 0,8 micrometer filters die bij -20 ° C worden bewaard voor de gemeenschap analyse. Grotere poriegrootte filters kunnen worden gebruikt voordat deze stap voor zeer productieve systemen. Voor het verkrijgen van ultra gefiltreerde water uit een Amicon M12-systeem (Millipore) een 30 kDa-cut-off spiraal cartridge wordt gebruikt voor alle virussen uit te sluiten, zelfs kleine RNA-virussen. De monsters worden verwerkt en geconcentreerd op ~ 25% snelheid met ~ 15 tot 16 kPa van tegendruk. De resterende steekproef van ~ 500 ml water bevat een geconcentreerde virus gemeenschap (die kan worden opgeslagen voor andere experimenten), terwijl de resterende 19,5 L van virus-vrij water zal worden gebruikt voor de productie van virale assays. Na elke dag van gebruik, moet het Amicon M12-systeem worden gereinigd om schade aan het membraan van de filterpatroon te voorkomen. Als u werkt met zeewater, spoel het membraan uit met minstens 6L van Milli-Q water, gevolgd door een wassen met 0,1 N NaOH-oplossing gedurende 30-45 minuten. Weer spoelen de cartridge met minstens 6L van Milli-Q water. Als u klaar bent met het M12-systeem, zou de spiraal patroon worden opgeslagen in een 0.05MH 3 PO 4 oplossing bij 4 ° C. 2. Virus Reductie Methode voor virale productie (Wilhelm et al.. 2002) Tot 500 ml van het zeewater / lakewater monster met zowel gastheer en virussen wordt verkregen en geplaatst in een sterifilter eenheid met een 0,2-um een ​​nominale poriegrootte lage eiwitbinding filter (bijv. Durapore) op het apparaat geplaatst. Het monster wordt zachtjes vacuüm druk op <200 mmHg, terwijl voortdurend resuspenderen het monster met behulp van een steriele transferpipet om bacteriële cellen te remmen uit te concentreren op de filter. Langzaam drie volumes van ultrafiltraat worden toegevoegd aan de bacteriesuspensie significant te verminderen van het aantal vrije virussen in het monster. De bacteriële fractie wordt verdund terug tot 500 ml met virus-vrij water en verdeeld in drie herhalingen van 150 ml per stuk en zijn geplaatst in duidelijke 250ml polycarbonaat flessen. 3. Tangentiële Flow Filtration (TFF) Methode voor Virale Productie (Weinbauer et al.. 2.002, Winget et al.. 2005) TFF stelt een alternatieve aanpak voor de reductie van het virus-methode. Ongeveer 500 ml van natuurlijke monster wordt zoals hierboven beschreven. Dit monster wordt geconcentreerd met behulp van een 0,2-um een ​​nominale poriegrootte tangentiële flow filtratie systeem. Wanneer de bacteriële fractie is teruggebracht tot ongeveer 10-15 ml, is ultrafiltratie, virus-vrij water toegevoegd en verdeeld zoals hierboven. De identieke flessen worden geïncubeerd bij in situ-omstandigheden met behulp van klimaatkamers. Lichtniveaus worden gewijzigd aan de oppervlakte omstandigheden met behulp van blauw getint acryl of helder acryl met een netto-screening om de lichtintensiteit te verlagen. Omgevingstemperatuur oppervlaktetemperaturen worden vaak verkregen door middel van een vloeiende zeewater dek incubator. Monsters voor bacteriële en virale overvloed schattingen zijn genomen op tijdstip 0 met een uiteindelijke concentratie van 2,0-2,5% steriele glutaraldehyde toegevoegd in cryovials. Deze monsters worden onmiddellijk flash bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bevroren tot verwerkt. Als vloeibare stikstof is niet beschikbaar is, kan microscoopglaasjes worden bereid en onmiddellijk verwerkt (zie procedure hieronder) Deelmonsters worden verzameld om de 2,5 uur voor ten minste 10 uur door de hierboven beschreven werkwijze. Op dit moment water kan worden verzameld voor kwantitatieve PCR analyse. Tot 5 ml van het monster kan worden toegevoegd aan een cryovial zonder fixatief agent met onmiddellijke flits bevriezen in vloeibare stikstof. 4. Virale Productie Microscopie (Noble & Fuhrman 1998, Wen et al.. 2004) Bevroren monsters tot 0,02-um worden gefilterd voor microscopie moeten worden ontdooid op ijs. Bereid een voorraad oplossing van SYBR Green door verdunning van de stockoplossing 01:10 met steriel water. Vervolgens uit de voorraad opgelost, een werkende oplossing door het toevoegen van 1 ml van de stamoplossing tot 39 ml steriel water. Een 50% glycerol, 50% fosfaat gebufferde zoutoplossingen (PBS, 0,05 M Na 2 HPO 4, 0,85% NaCl, pH 7,5) en verse 2,5% voorraad oplossing van p-fenyleendiamine moet ook worden voorbereid voordat u begint. Houd de 50% glycerol/50% PBS-oplossing bij 4 ° C en de p-phenylenediamine voorraad bij -20 ° C in het donker tot de start. Recht toe te voegen voordat het filteren van de p-fenyleendiamine aan de 50% glycerol/50% PBS tot een uiteindelijke concentratie van 0,1% om te worden gebruikt als de Antifade oplossing. Plaats een 25 mm 0.02-um Anodisc filter op de top van een 0,45-um MicronStep, cellulose steun filter. Voeg 850 ul van de vaste monster naar de top van de Anodisc en vacuüm bij 20 pKa tot het volledig gedroogd. Plaats 100 pl van SYBR Green werkende oplossing voor een steriele petrischaal en, met het vacuüm nog op, voorzichtig de Anodisc te verwijderen uit het filter toren en plaats op de SYBR Green. Incubeer de monsters in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Verwijder voorzichtig het filter uit de SYBR Green oplossing en pit de achterkant van het filter met een Kimwipe alle overblijvende kleurstof te verwijderen. Indien gewenst, terug het filter naar de toren en geef tot 800 ul van 0.02-um gefilterd water of steriele media door het filter te spoelen overtollige vlek. Voeg een kleine druppel antifade oplossing op een objectglaasje en plaats een deksel slip op de top. Verwijder het deksel glijden en voeg de gedroogde filter om de microscoop schuiven nat met de antifade oplossing. Opnieuw, voeg een kleine hoeveelheid antifade oplossing voor het dekglas en langzaam te plaatsen op de top van het filter, en zorg ervoor om zich te ontdoen van eventuele luchtbellen die zich kunnen vormen. Onmiddellijk te bevriezen de dia's bij -20 ° C totdat het nodig is (deze moet worden gebruikt binnen een paar maanden om verkleuring te voorkomen en verlaagde virus telt) Virussen zijn opgesomd met behulp van fluorescentie microscopie (in ons geval een Leica DMRXA microscoop) met een brede blauwe filter set (λ Ex = 450 tot 490 nm, λ = 510 nm Em met een onderdrukking filter bij λ = 510 nm). Elk filter heeft minstens 20 gebieden geteld bekijken, zorg ervoor dat de totale virussen kwantificeren van elk veld net een gelijkmatige verdeling van virussen over het filter membraan te verzekeren. Gemiddelde tarieven van het virus herhaling van de drie onafhankelijke herhalingen worden dan berekend en een standaarddeviatie wordt bepaald door de productie-tarieven. 5. Representatieve resultaten De ruwe gegevens verzameld door de onderzoeker vereist minimale wiskundige bewerking om herhaling tarieven van het virus overvloed te genereren. De primaire gegevens als gevolg van deze studie is de herhaling tarieven van het virus overvloed in de deelmonsters van de incubaties. Deze resultaten vormen onafhankelijk regressies van het virus overvloed versus de tijd voor elk van de monsters. Voor elk monster de individuele incubaties fungeren als een behandeling, zodat door het invullen van drie gelijke-incubatie kan de onderzoeker berekening van de rente, alsook een schatting van de variatie (bijvoorbeeld standaarddeviatie) (zie figuur 1). Een waarschuwing van dit proces is dat de vermindering van virus overvloed onveranderlijke leidt tot een vermindering in de ontvangende cellen in het monster die het dragen van de last virus. Ter compensatie van dit verlies, opsomming van bacteriële overvloed van zowel de bron (ongefilterd zeewater of meer water) en de T = 0 incubatie monster nodig. Deze informatie kan gebruikt worden om rekening te houden voor het percentage van de verloren cellen: de veronderstelling dat het proces van het verminderen van virus overvloed niet selectief is voor of tegen een lid van de microbiële gemeenschap, deze factor kan dan gebruikt worden om de raming van de in situ productie snelheid van virussen . Figuur 1. De productie van virusachtige deeltjes over een 10 uur incubatie bij in situ-omstandigheden met behulp van epifluorescentie microscopie. Monsters werden verzameld tijdens een algenbloei voor de kust van Nieuw-Zeeland in september 2008. Figuur 2. Schematische weergave van de workflow-proces voor het testen virus productie. Het proces begint met de ultrafiltratie van het monster water om virus-vrij water te genereren. Dit is ingevuld met behulp van een ultrafiltratie-systeem. Parallel watermonsters worden verzameld van dezelfde site en de vrije virussen geleid door een filter, terwijl de microbiële gemeenschap (die een mengsel van besmette en niet-geïnfecteerde cellen) blijft behouden. Deze gemeenschap wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd in het virus vrije water en geïncubeerd onder in situ-omstandigheden. De herhaling snelheid van virussen wordt dan gecontroleerd op de komende 10 uur om de tarieven van het virus de productie te bepalen.