Stratégies pour l'étude de neuroprotection du froid préconditionnement

Techniques stériles et aseptiques sont essentiels à la préparation, l'entretien et l'utilisation de cultures tranche pendant des périodes prolongées. Par ailleurs, la raison d'être de notre utilisation de cultures tranche seulement après 18 jours in vitro est basé sur des preuves qui indique excitateurs et inhibiteurs de la transmission synaptique devient plus mature, et les cellules gliales (astrocytes et la microglie) deviennent quiescentes et conforme à leur homologues dans vivo (figure 1 ). 1. Préparation et entretien des cultures Slice hippocampe Le jour même de la culture, à équilibrer inserts stériles dans 1,1 milieux de croissance mL constitués de 50 mL Basal Medium Eagle, 25 ml de solution saline équilibrée de Earle, 23 ml Sérum de cheval, 0,5 mL Glutamax (200 mm stock), 0,1 ml de gentamicine (10 mg / mL stock), 0,4 ml Fungizone (250 pg / ml), 1,45 ml de D-glucose (45%, 42 mM totale). Gardez à six puits plateaux dans une étuve à 36 ° C, le dioxyde de carbone de 5% et 95% d'humidité. La stérilité maximale, la culture est idéalement effectuée dans une chambre filtré HEPA pression positive culture avec l'air aussi purifié via autonomes lumière ultra-violette d'air de nettoyage ventilateurs, et, tout en portant une blouse propre et des gants stériles tendue sur les manchons blouse de laboratoire . Préparer cultures tranche dans une hotte laminaire BSL-1 fumée qui comprend tout le matériel nécessaire (c.-à-tissue chopper McIlwain, inserts en téflon connexes, lame de rasoir tranchage, le froid dissection (3-4 ° C) plaques, outils chirurgicaux, et la dissection des boîtes de Pétri) l'aide d'un Wild (M8) stéréomicroscope. Permettre à la plaque de refroidissement (exécuter à partir d'un bain d'eau proche) pour atteindre la température 3-4 ° C pendant au moins 30 minutes tout en même temps à exposer les matériaux de dissection à une lumière ultraviolette pour établir en outre la stérilité de la zone de dissection et d'outils. La hotte à flux laminaire est testé périodiquement pour s'assurer de la lumière ultraviolette a une puissance suffisante à la tablede haut niveau avec un mètre ultraviolets à ondes courtes de mesure de la lumière. Utilisez les ratons (P8-P9 et ~ 23 g / ch. D'portées abattus à 10 à la naissance) anesthésiés avec du dioxyde de carbone à 100% dans une boîte de petit animal sur un banc aseptique derrière la hotte et nettoyés par trempage dans de l'éthanol à 100% dans les la hotte d'aspiration, où toutes les étapes suivantes sont effectuées. Décapitez chiots dans une moitié d'une boîte de Petri de 100 mm et placer la tête au second semestre, avec un plat frais par chiot. Disséquer le cerveau et le placer dans la moitié inférieure d'une boîte de 60 mm de Petri contenant 10 ml stérile à froid (3-4 ° C) Gey Balanced Salt Solution complétée par D-glucose à 6,5 mg / ml (soit 7,5 ml de 45 % d-glucose par bouteille de 500 ml de Gey. Disséquer l'hippocampe de chaque hémisphère et placez-les sur un disque en téflon pour le hacheur McIlwain. Médias propagent à partir du tissu cérébral à l'aide d'une spatule d'iris pour éviter des coupes de cerveau de coupeadhérant à la lame de coupe. Section perpendiculaire à leur axe hippocampes long en utilisant l'hélicoptère McIlwain, avec épaisseur de coupe réglée à 350-400 um. Vivement lavage fraîchement coupé tranches hors des inserts en téflon et dans la moitié supérieure d'une boîte de 60 mm de Pétri contenant du froid (3-4 ° C) Solution saline équilibrée de Gey avec 6,5 mg / ml de D-glucose à l'aide d'une micropipette, un ml. Inspecter des coupes au microscope stéréoscopique pour un gyrus denté et intacte couche de cellules pyramidales. Placez délicatement les grandes tranches sur un insert (trois par insert et 12 tranches / chiot) et de maintenir dans des conditions normales d'incubation dans un incubateur nettoyé tous les six mois et étalonnés tous les trois mois avec un analyseur de dioxyde de carbone à infrarouge et thermomètre de précision à une décimale près. Milieux de culture en boîtes de culture de rafraîchissement tous les 3-4 jours in vitro en utilisant une hotte BSL-2 et une technique stérile. Au bout de 7 jours in vitro,remplacer le support avec 1,1 mL du milieu sans sérum (SFM) constitués de 97 ml Neurobasal, 2 ml B27, 0,5 mL Glutamax (200 mM), 0,1 ml d'acide ascorbique (0,5 M) et 0,68 ml de D-glucose (45%, 42 mM total). 2. Présélection vitalité des cultures Slice Aliquoter Sytox produits écologiques (10 pi) et conserver à -20 ° C. Diluer actions Sytox à la concentration de 500 nM travailler dans un milieu de croissance sans sérum (soit 10 uL dans les médias 100 mL). Magasin Sytox médias à 4 ° C et utiliser jusqu'à une semaine. Lieu 1,1 mL de Sytox par puits dans des boîtes de culture à 6 puits et chaude à 36 ° C au dioxyde de carbone à 5% pendant une période suffisante (par exemple, comme en témoigne l'absence de condensation sur des boîtes de culture). Pendant ce temps, permettre une lampe à ultraviolet (par exemple, une source de lumière fluorescente avec un filtre FITC) effectuée par l'intermédiaire d'une alimentation stabilisée à assurer l'intensité lumineuse uniforme à réchauffer à la température pendant au moins 20 min. Cultures tranche Place (18 jourss in vitro) en Sytox-média pendant 10 min, puis de nouveau à la GDF à l'écran pour blessures irréversibles CA1 couche pyramidale. Voir cultures sur une surface aseptique d'un microscope inversé, examinés sous un grossissement de 5x. Accepter des cultures avec moins de 30 Sytox cellules positives dans la région CA1. 3. Froid Préconditionnement Lieu 1,1 mL de la GDF dans des boîtes de culture à 6 puits. Laisser un support refroidi (par exemple, 30 ° C) à s'équilibrer dans un incubateur (dioxyde de carbone de 5% et 95% d'humidité) pendant au moins 20 min avant utilisation. L'absence de condensation sur des boîtes de culture indique que le temps nécessaire pour atteindre l'équilibre s'est produite. Transférer des inserts de culture de section de support refroidis (1,1 ml / puits) de plateau maintenu à 30 ° C et incuber pendant 90 min à l'aide d'une technique stérile sous une hotte à fumées BSL-2. Placez les cultures tranche de retour à la GDF normale dans des conditions normales d'incubation de 24 heures, à nouveau en utilisant une technique stérile via un BSL-2 hotte. 4. Blessure excitotoxique Commencez la culture tranche utilisation présélectionner expérimentale en l'exposant à Sytox médias pendant 20 min. Acquérir des images de tranches individuelles avec des tranches maintenus à une orientation similaire à celle utilisée pour présélectionner (images de fond). Ceci est fait en plaçant une marque sur la gauche et deux à droite marques avec un stylo marqueur à «10» et «deux» heures sur chaque insert. Cette manœuvre facilite l'utilisation de la même zone de forme d'intérêt pour chaque culture une série d'images. En même temps, mettre en marche la source de la lampe ultraviolette (sous alimentation régulée), et la caméra CCD pour un minimum de 20 min, de manière qu'ils se réchauffer à la température. Ensuite, calibrer la caméra CCD avec une norme fluorescéine. "Effacer" du CCD en l'exposant à la lumière pendant 50 cycles, à moins qu'une calibrage automatique CCDcaméra vidéo est utilisée. Nous avons mis en place un programme dans MetaMorph pour effacer notre caméra snap cool utilisée pour la quantification des blessures. Placer 10 ul de fluorescéine dans 90 ml de PBS (tampon phosphate 10 mM, NaCl 150 mM pH à 7,3) et vortex. Pipeter 10 ul de mélange fluorescéine sur un 100 hématimètre profonde um. Réglez l'intensité de l'image complète à 1000/4096. Recueillir des images de fond de cultures tranche de vérifier que le préconditionnement à froid n'a pas causé de blessure (c.-à-jeter les cultures ≥ 250 CA1 zone d'intensité d'intérêt). Préparer les plateaux avec les médias NMDA. Préparer une solution à 10 mM de NMDA actions au moins chaque semaine. Pour lésion excitotoxique, diluer NMDA à 20 50 uM de l'AFD et équilibrer les conditions normales d'incubation pendant au moins 20 min. En utilisant le BSL-2 Capot et technique stérile, inserts placer dans le NMDA médias pendant 60 minutes dans des conditions normales d'incubation. Rinçage hors de NMDA inserts en trempant chaque insert trois fois dans trois boîtes de 60 mm distinctes contenant chacune 10 ml Neurobasal chauffées à 36 ° C. Ne pas utiliser plus de trois inserts pour chaque ensemble de trois boîtes de 60 mm de lavage. Retour cultures à des conditions normales d'incubation. Recueillir des images de blessures 24 heures après l'exposition au NMDA. Étalonner la caméra à la fluorescéine standard tel que décrit ci-dessus. Placer les cultures dans les médias Sytox pour 20 min. Quantifier des blessures: En utilisant le logiciel MetaMorph, dessinez une zone d'intérêt autour de la région CA1. Mesurer l'intensité de la zone sélectionnée pour "dommage". Copiez et collez AOI de "dommage" "fond" image. Entrez les valeurs de «préjudice» et «arrière-plan» dans Excel. Quantifier "numérateur de fond" pour le contrôle et froid préconditionnés cultures. En utilisant le logiciel statistique (par exemple, SigmaStat), exécutez des tests statistiques appropriés pour comparer les blessures du groupe expérimental (s) par rapport à un groupe témoin, qui doit toujours être inclus dans chaque série expérimentale. Remarque: Si les niveaux de blessures sont faibles en une journée après la lésion images, d'effectuer l'expérience de deux trois jours. Protection des cultures peut être masqué en raison d'un manque de sensibilité aux blessures (figure 2). Note: La question de la «protection» nous a incité à passer à la gravité des blessures de mesure et non ratios pour toutes les comparaisons (figure 3). 5. Co-traitements appliqués à froid préconditionnement Un avantage important des cultures tranche est que la condition de l'environnements peut être contrôlée avec précision. Cela signifie que la signalisation des cytokines de préconditionnement à froid peut être mesurée, imité, et modulé à disséquer les aspects noeud critique. Recombinants (par exemple, un agoniste) et la neutralisation des protéines (par exemple, un anticorps ou un récepteur soluble) les protéines peuvent être utilisées pour reproduire et moduler, respectivement, de signalisation des cytokines. En général, ces protéines sont reconstitués et conservés sous forme d'aliquotes à -20 ° C pour une utilisation dans les six mois afin d'assurer la bioactivité adéquate. Ici, nous décrivons exemple d'utilisation de TNF-α abrogation de signalisation du récepteur du TNF soluble en utilisant 1 (sTNFR1). Reconstituer sTNFR1 dans du sérum bovin albumine à 0,1% dans du PBS à un stock de 50 pg / mL, aliquot de 20-50 quantités uL, et conserver à -20 ° C. Pour l'utilisation, diluer sTNFR1 à 200 ng / mL dans la tranche des médias cultures croissance réchauffé à 36 ° C et cultures tranche placer dans sTNFR1-média pendant 20 minutes avant to froid préconditionnement. Remarque: Pour réduire la variance, il est préférable de diluer 200 ng / mL sTNFR1 dans un grand volume de milieu de culture (par exemple, 1:250 dilution de 50 ug / ml sTNFR1 stock dans 10 ml de milieu de croissance nécessite 40 uL sTNFR1) vs ajoutant sTNFR1 directement à chaque puits dans le plat (4,4 pi par ml de milieu 1.1). Diluer sTNFR1 à 200 ng / mL dans les médias et placer 1,1 ml dans chaque insert bien. Permettre aux médias s'équilibrer à 30 ° C pendant au moins 20 min avant l'exposition de cultures de tranches de préconditionnement à froid pendant 90 minutes comme décrit plus haut. Cultures tranche Place Revenir à 36 ° C avec sTNFR1 présente dans les médias. 24 heures plus tard, d'exposer les cultures à Sytox médias pendant 20 minutes comme précédemment décrit et collecter des images de fond pour vérifier que froid préconditionnement ne pas blesser les cultures. Quantifier les données telles que décrites ci-dessus. Actualiser les médias avec des composants tous les 3-4 jours in vitro. 6. Immédiate et retardée après lésion excitotoxique froid préconditionnement Blessures immédiates de froid-préconditionnement. Effectuer froid préconditionnement comme décrit ci-dessus. Après préconditionnement à froid, retourner à l'incubation des cultures normale pendant 20 min. Ensuite, exposer cultures à 20-50 uM NMDA blessures pendant une heure. Rincer les cultures trois fois comme décrit ci-dessus et revenir à la normale d'incubation. Après 24 heures, acquérir des photos des blessures, comme décrit ci-dessus. Des effets à retardement de froid préconditionnement.lpha "> Effectuer froid préconditionnement comme décrit ci-dessus. Exposer à des cultures NMDA blessures 24 heures plus tard, comme décrit ci-dessus. Continuer d'acquérir des images de blessures pour un maximum de trois jours après la première à froid préconditionnement de surveiller la protection. 7. RNA Isolation Les procédures suivantes sont l'expression des gènes mis à l'échelle pour une culture seule tranche. Transfert cultures tranche du milieu de croissance et d'incubation normale à 3 RNAlater ml dans des boîtes de culture à 6 puits pour stabiliser l'ARN. Conserver à 4 ° C pendant trois jours, jusqu'à ce traité comme décrit ci-dessous. Soulevez délicatement la culture tranche de l'insert avec un pinceau à pointe fine et sa place dans 1 ml de froid (4 ° C) PBS dans un tube de 1,5 ml (DNase, RNase et ADN libre). Centrifuger les échantillons pendant 30 secondes et supprimer PBS surnageant. Stockerles échantillons à -80 ° C. Pour isoler l'ARN à partir de cultures tranche (~ 250 ng / ch.), Des échantillons de dégel sur la glace. Isoler l'ARN en utilisant Qiagen kit MicroRNeasy via les procédures suivantes qui sont décrites plus en détail et adapté du Manuel RNeasy Micro (Qiagen). Lieu 350 uL de tampon RLT (contenant 10 pl β-mercaptoéthanol par ml) dans chaque microtube contenant une culture tranche. Homogénéiser les échantillons au vortex pendant 30 secondes. Triturer tissu, si nécessaire (par exemple, les tissus granulés encore visible) à l'aide d'un pilon jusqu'à ce que complètement jetable homogénéisé dans le tampon RLT. Lieu 350 ul d'éthanol à 70% dans le mélange lysat et pipette pour mélanger. Transfert homogénat à une colonne de centrifugation et le placer dans un tube de prélèvement (colonne de centrifugation à la fois et le tube collecteur sont fournis par Qiagen). Centrifuger l'échantillon pendant 15 secondes à la vitesse maximale. Conserver la colonne. Laver la colonne d'essorage en ajoutant 350 ul de tampon RW1, plus centrifuger 15 sec à vitesse max. Jeter le tampon. Diluer 10 ul de DNase I dans 70 pl de tampon RDD pour donner 80 ul de volume total. Introduire à la pipette doucement pour mélanger ne pas vortexer. Préparer 80 ul de DNase dilué par échantillon. Incuber à température ambiante pendant 30 min. Ajouter 350 ul de tampon RW1 pour déguster la colonne et centrifuger pendant 15 sec. Jeter le tube collecteur. L'utilisation d'un nouveau tube collecteur, ajouter 500 ul de tampon RPE échantillon et centrifuger pendant 15 secondes et le tampon de défausse. Placer 500 uL d'éthanol à 80% sur l'échantillon et centrifuger pendant 2 min. Jeter le tube collecteur. Sécher les colonnes de centrifugation par centrifugation pendant 5 min à vitesse maximale avec bouchons des tubes ouverts, jeter les tubes de prélèvement, et la colonne de transfert de spin dans un tube de 1,5 ml de collecte fourni par le kit. Pour collecter des ARN isolés, place 14 ul d'eau sans RNase sur le centre de la membrane de la colonne. Centrifuger pendant une minute et recueillir le liquide. Ajouter 2 ul de RNasin (dilué à 1 U / ul dans du tampon TE) et conserver à -80 ° C. Un tampon TE est constitué de 10 mM de Tris (tris [hydroxyméthyl] aminométhane), 1 mM d'EDTA (acide éthylènediamine hydrate de sel disodique) à pH 8,0. 8. Quantification ARN Remarque: RNasin n'interfère pas avec le dosage RiboGreen. Diluer à 1:200 dans RiboGreen RNase-free tampon TE comme suit. TE (ml): 1; RiboGreen (ul): 5; TE (ml): 4; RiboGreen (pi): 20; TE (ml): 6; RiboGreen (pi): 30. Normes d'ARN sont préparés comme suit. <li> ARNt de levure est utilisé comme étalon ARN. ARNt est stocké (-20 ° C) telle que 1 mg / ml dans du tampon TE. Diluer de 1 mg / mL de stock 1:100 dans du tampon TE, en utilisant (DNase, RNase et ADN libre) 1,5 ml microtubes de produire une norme 1 ug / ml de travail. Préparer la courbe d'étalonnage directement dans une plaque d'essai 96-puits fluorescent en ajoutant le diluant premier tampon TE, puis en ajoutant la quantité appropriée de la 1 pg / ml, dans le tampon TE déjà dans les puits de la plaque, comme indiqué dans le tableau ci-contre. Faire des puits en double pour chaque norme comme suit. Vol. de std. (Ul): 100; vol. de TE (ul): 0; ARN dans bien (ng): 100; Vol. de std. (Pi): 80; Vol. de TE (ul): 20; ARN dans bien (ng): 80; Vol. de std. (Pi): 60; Vol. de TE (ul): 40; ARN dans bien (ng): 60; Vol. de std. (Pi): 40; Vol. de TE (ul): 60; ARN dans bien (ng): 40; Vol. de std. (Pi): 20; Vol. de TE (ul): 80; ARN dans bien (ng): 20; Vol. de std. (Ul): 0; Vol. de TE (ul): 0; ARN dans bien (ng): 0. L'essai est préparé comme suit. Ajouter 99 ul de tampon TE à chacun des puits d'échantillons de la plaque de 96 puits. Le moyen le plus efficace pour ce faire est d'utiliser une pipette multicanaux. Ajouter 1 ul d'ARN dans les puits échantillons expérimentaux. Ajouter 100 ul de la RiboGreen dilué dans chaque puits en utilisant la pipette multicanaux et triturer avec un ou deux coups de la pipette. Lire la plaque sur un lecteur de plaque fluorescente à 480 nm d'excitation et 520 nm d'émission. Moinstruct une courbe standard à l'aide de Microsoft Excel avec des intensités de fluorescence mesurées des normes d'ARN. Calculer les concentrations d'ARN dans des échantillons en utilisant l'équation résultante linéaire de la courbe des normes. 9. SYBR Green PCR quantitative Les procédures de PCR sont mieux fait dans un endroit propre réservés spécifiquement pour le travail avec de l'ARN (figure 4). Décontaminer la surface et de l'équipement de laboratoire de contamination liés à l'ADN et un potentiel d'activité RNase avant utilisation avec de la lumière ultraviolette, l'eau de Javel à 10% ou à l'extérieur de RNase. Porter des gants de toutes les procédures. Utilisez RNase eau gratuite pour tous procédures fournies avec le kit. Ne pas utiliser DEPC (pyrocarbonate de diéthyle) de l'eau traitée. Fermez tous les tubes PCR liées immédiatement après utilisation pour retarder la contamination par aérosol d'ADN étranger. Développer et caractériser des amorces pour l'ARNm cible (s) d'intérêt. Ces méthodes sont détaillées dans les méthodes complémentaires à Hulse et al., Journal of Neuroscience, 2008 13. ADNc est produit de 30 à 200 ng d'ARN total par transcription inverse en utilisant iScript. Le choix de la quantité d'ARN de départ est déterminée par la quantité totale d'ARN disponible dans le but d'effectuer une analyse par RT-PCR sur une portion de l'échantillon (par exemple, 10% -20% du total). La plus grande partie restante de l'ARN est stocké pour une analyse ultérieure. Le kit iScript utilise un mélange d'hexamères aléatoires et des amorces oligo-dT, et une transcriptase inverse MMLV modifié dans un volume total de 20 pl. Inverser le produit de transcription de 25 ° C pendant 30 min puis 42 ° C pendant 50 min, et la transcriptase inverse est ensuite dénaturé unt 85 ° C pendant 5 min. Diluer l'ADNc dans un tampon TE à une concentration finale de 0,4 ng / pi par rapport à la quantité d'ARN de départ. SYBR Green PCR basée sur la stratégie est utilisée pour amplifier l'ADNc. Les réactions de PCR sont contrôlées en temps réel en surveillant SYBR Green incorporation. Les 50 réactions ul contiennent 3 mM de MgCl2, 200 uM dNTP, 15 pmol de chacune des amorces sens et antisens, 1 uM, la fluorescéine 1x colorant SYBR Green, 10 uL (4 ng) culture tranche d'ADNc, et 1,25 U de Taq polymerase Platinum en réaction tampon constitué de 50 mM de KCl et 10 mM de Tris, pH 8,3. La PCR est réalisée en utilisant le thermocycleur iCycler qui peut recueillir les données en temps réel. Paramètres de cyclage se composent de 15 sec de dénaturation (95 ° C), suivie de 30 sec d'hybridation / extension (60 ° C) a répété 45 fois. Optique mesugences sont prises lors de l'étape de recuit / extension et les valeurs de Ct ont été déterminées à l'aide du logiciel de système iCycler. ADNc pour cibles des cytokines d'intérêt et de β-actine sont utilisés pour construire des courbes d'étalonnage. Le nombre de copies est déterminé à partir de la masse moléculaire et de masse de l'ADNc du plasmide. Les courbes d'étalonnage de nombre de copies / masse sont construits et inclus dans chaque essai. Valeurs CT pour chaque dilution d'ADNc sont utilisés pour déterminer le nombre de copies c Ct courbe. Les niveaux de cytokines et de β-actine nombre de copies sont déterminées avec des échantillons à l'aide des courbes d'étalonnage. 10. PCR quantitative pour puces à ADN Quantitative en temps réel de dépistage gamme qPCR est une très sensible et reproducible moyen de sonder à faible niveau d'expression de médiateurs inflammatoires changements. Le RT2 Profiler PCR tableau à partir SABiosciences est utilisée pour des changements d'expression de gènes inflammatoires médiateur, avec les étapes suivantes, décrites plus en détail par le fabricant. Le test utilise 0,1 à 1,0 pg d'ARN. Nous utilisons les zones tranche locales (par exemple, CA1 qui fournit environ 250 ng d'ARN total à partir de deux échantillons groupés) ou entiers tranches individuelles contenant une quantité similaire d'ARN total. ARN exemples et de contrôle sont une transcription inverse en ADNc en utilisant un kit de premier brin (par exemple, C #-03). L'ADNc obtenu est mélangé avec SYBR Green PCR basée mélange (# PA-011) et 25 ul aliquotes dans chacun des 96 puits de la plaque de matrice PCR (mesure 84 gènes uniques expérimentales et 16 gènes de ménage). Une plaque de matrice est préparée pour l'échantillon expérimental et une seconde plaque est préparé pour la commande. Remarque: Le mélange SYBR maître vert fourni par le fabricant est thermocycleur spécifique. Cyclage thermique est effectué en utilisant un protocole avec une iCycler 40 cycles comprenant une étape de dénaturation de 15 secondes de moins 95 ° C, suivie d'une étape d'extension d'une minute à 60 ° C. Les données optiques sont collectées lors de l'étape d'extension. Le cycle thermique est suivie par analyse de la courbe de fusion balayant la gamme de 55-95 ° C de la température de 0,5 ° C par incréments. L'expression relative de gènes dans des plaques traitées et témoins a été déterminée en utilisant le 2 – Méthode ΔΔCt l'aide du logiciel Excel fourni base et exprimé en multiplication ou une diminution par rapport aux témoins. Gènes avec deux plis augmentations ou des diminutions d'expression sont pris en considération pour une évaluation plus poussée. Les gènes identifiés du dépistage gamme PCR (par exemple, en utilisant # PARN-011A à froid préconditionnement) sont plus CONFIRMEd en utilisant qPCR. Matrices PCR identifier les gènes qui sont régulés en réponse à des stimuli. Dans l'exemple de préconditionnement froid, nous avons identifié le gène IL-11 comme positivement régulé en réponse au froid préconditionnement. L'étape suivante de l'analyse consiste à confirmer que le gène nouvellement identifié est réglementée dans les cultures tranche en utilisant le qPCR décrite ci-dessus. 11. Multiplex de flux de microsphères de dosage par cytométrie en protéomique Exposer les cultures tranche à froid préconditionnement comme décrit ci-dessus. Cultures tranche de récolte pour le dosage des protéines totales. Soulevez délicatement les tranches au large de l'insert à l'aide d'un pinceau à pointe fine et le lieu dans 1 ml froide (4 ° C) PBS. Centrifuger les tubes et enlever PBS hors cultures tranche. Placer sur la glace sèche jusqu'à la récolte est terminée. Conserver les tubes à -80 ° C. Homogénéiser tranche des échantillons de culture pour réaliser un dosage de protéine totale. Préparer un tampon de lyse cellulaire pour l'homogénéisation. En suivant les instructions du fabricant (Bio-Rad), ajouter des inhibiteurs de protéase à 5 ml de tampon de lyse et mis de côté sur la glace. Placer 100 ul de tampon de lyse sur des cultures de tranche et les tranches agiter par pipetage de haut en bas cinq fois avec une pointe de pipette 100 ul découpé à 1 mm. Agiter les échantillons sur la plaque agitateur à 4 ° C pendant 20 min. Centrifuger les échantillons à 13000 rpm pendant 15 min à 4 ° C. Transférer le surnageant dans un tube propre et prévu sur la glace. Effectuer dosage des protéines totales. Préparer BSA (sérum albumine bovine) les normes de protéines. Reconstituer actions BSA avec de l'eau ultrapure selon les instructions du fabricant. Préparer les étalons de protéines allant de 0 à 1000 pg / ml, diluée dans un tampon de lyse. Calculer le volume de réactif de travail nécessaire selon les instructions du kit. Par exemple, (huit normes + 18 échantillons inconnus) x (deux répétitions) x (200 uL de réactif de travail requis par échantillon) = 10,4 mL de volume total de réactif de travail nécessaire pour charger sur une microplaque de 96 puits (par exemple, analyse de flux de microsphères cytométrie , voir ci-dessous). Lorsque le mélange réactif A avec le réactif B, une turbidité peut se produire, mais devrait disparaître sous peu. Chargez 10 uL d'étalons et d'échantillons sur microplaque. Chargez 0,2 mL de réactif de travail dans les puits. Couvrir avec du film adhésif pour microplaques et agiter Agitateur de plaque pendant 30 sec. Microplaque incuber à 37 ° C pendant 30 min. Microplaque refroidir à température ambiante (environ 10 minutes) avant de lire sur un lecteur de plaques à 595 nm de longueur d'onde. Construire une courbe standard à l'aide de Microsoft Excel avec absorbances mesurées de normes BSA. Calculer la concentration de protéines dans les échantillons en utilisant l'équation résultante linéaire de la courbe des normes. Diluer les échantillons à la plus faible concentration mesurée avec un tampon de lyse et conserver à -80 ° C. Parformer des essais mono-plexes et les tissus cytokines multiplex (ou fluide), comme indiqué dans le détail complet dans les références n ° 12 et 16. 12. Immunohistochimie Fixer les cultures pendant 24 heures avec un fixateur PLP composé de 10 ml de paraformaldéhyde 16%, 1,096 g de lysine, 0,42 g de phosphate de sodium et 0,17 g de sodium periodate, rempli d'un volume total de 80 ml avec de l'eau ultra-pure (fixateur est de 6,2 pH). Nous constatons que fixateur PLP est un fixateur doux qui permet la détection de bas niveau immunomarquage qui, autrement, ne serait pas évidente à l'aide d'autres fixateurs. Cultures sont fixées pendant 24 heures, puis transférés avec un pinceau fin à l'azoture de sodium contenant du PBS (100 mg / L). Immunomarquage champ visuel lumineux flottants cultures entières tranche s'effectue comme suit, avec toutes les mesures couplées à des secousses à ~ 50 min. Laver les cultures tranche en 3 ml de PBS à trois reprises pendant 10 min. Quench cultures tranche dans 0,3% H 2 O 2. Diluer 30% H 2 O stock 2 dans du PBS. Laver les cultures tranche de PBS à trois reprises, à 10 min chacun. Bloquer cultures de tranches pendant une heure à température ambiante dans 3 ml de la solution de blocage dans une plaque de six puits constitué par 10 ml de sérum de chèvre, 0,75 ml de Triton X-100, et 89,25 ml de PBS. Sérum pour la solution de blocage doit provenir de la même espèce dans laquelle l'anticorps secondaire a été soulevée. Incuber les cultures tranche avec nuitées en anticorps primaire dilué dans une solution de blocage à 4 ° C. Le volume maximal de solution d'anticorps primaire pour les petits en verre Pyrex puits plat doit être de 0,3 ml des volumes plus élevés ont tendance à courir sur le bord de la plaque. Placer le plat dans un récipient fermé humidifié. Nous ne couvrons pas le plat de film adhérent puisque les articles peuvent être filée sur le film sus-jacente et perdu pour traitement ultérieur. Réglez la vitesse d'agitation de la plaque d'agitateur juste assez haut pour faire circuler tranches dans la solution d'anticorps. Retirer les tranches de la plaque de verre et laver dans du PBS à trois reprises pendant 10 minutes par lavage. Incuber l'anticorps secondaire dans les tranches à la température ambiante pendant une heure sous agitation. Utilisez de petits plats en verre Pyrex pour charger 0,3 ml de solution d'anticorps secondaire. Laver trois fois dans du PBS, 10 min par lavage. Visualisez coloration avec 3'-diaminobenzidine (DAB). Dissolvez 30 mg DAB dans 3 ml de diméthylsulfoxyde. Filtre DAB utilisant deux # 1 papier filtre et laver avec 54 ml de PBS. Immédiatement avant utilisation, ajouter 20 ul de 30% de H 2 O 2. Incuber les cultures en solution DAB pendant 5-7 min à température ambiante. Remarque: DAB est un cancérogène et doivent être éliminés de façon appropriée. Éliminer toutes les solutions DAB dans un récipient marqué stockées dans une hotte, et placer tous les petits plats dans l'eau de Javel pour désactiver DAB. Toutes les solutions DAB devrait finalement être mis au rebut par l'intermédiaire du Bureau de la sécurité institutionnelle. Laver les cultures tranches dans du PBS à trois reprises pendant 10 minutes chaque . Wet cultures tranche de montage à la gélatine (ou silane) des lames recouvertes avec 100 ul savon dissous dans de l'eau distillée. Sécher toute la nuit à température ambiante. Évitez d'utiliser des chauffe diaporamas chaleur excessive peut causer des fissures dans les cultures montés sur glissières. Déshydrater coulisse à travers une série d'éthanol à gradient (50, 75, 95, 95, 100, 100%) pendant 30 secondes chacun. Diapositives claires avec du xylène quatre fois pendant dix minutes chacun. L'utilisation d'un pipette Pasteur en verre, lieu de 0,1 mL de milieu de montage sur le dessus de la glissière et doucement lamelle pour éviter les bulles d'air forment. Sécher toute la nuit à température ambiante. Immunomarquage fluorescent. Cultures tranche de section à 20 um d'épaisseur à l'aide d'un cryostat.oman "> Réglez les paramètres de cryostat à -16 ° C pour la température interne, et -12 ° C pour température de l'objet. Placer une petite quantité d'eau sur le métal mandrin en utilisant une pipette Pasteur et le gel de la glace sèche. Appliquer une couche mince disque de Tissue-Tek médias sur le dessus du mandrin congelés. Laissez mandrin de geler et de s'équilibrer à température de la chambre du cryostat. Section Tissue-Tek médias afin de créer une surface aplatie adapté pour la pose cultures tranche plats. Notez l'orientation du mandrin tout en sectionnant cela fournit un angle constant pour la coupe qui va empêcher que des supports de montage de tomber du mandrin. Une fois congelées, prenez flanque à la porte et placer dans un récipient. En utilisant une spatule métallique et un pinceau à pointe fine, faites glisser une culture tranche sur la spatule et le transfert vers lemilieu de la couche aplatie du Tissue-Tek médias sur le mandrin. Placez une fine couche de Tissue-Tek médias sur la culture et le gel tranche de montée à la température de chambre pendant au moins 10 min. Avec le bouton "Trim" est activé, la section des couches supérieures de Tissue-Tek médias jusqu'à ce que la culture section est visible. Passer de "trim" à "section" préréglé à 20 um. Pick-up 20 sections um avec de la gélatine lames revêtues qui sont la température ambiante et lames sèches du jour au lendemain. Tissue-Tek médias sera visible sur les diapositives, mais se dissout dans les lavages PBS. Immunomarquage. Laver les lames dans du PBS trois fois chacune pendant 10 minutes. Étancher dans 0,3% de H 2 O 2 pendant 15 minutes àtempérature ambiante en agitant. Laver les lames dans du PBS trois fois chacune pendant 10 minutes. Utilisation SFX signal de enhancer, appliquez quelques gouttes de composant A directement sur le dessus des sections sur lame et incuber pendant 30 min à température ambiante dans une chambre humide. Incubation avec le composant A remplace l'étape de blocage avec une solution 10% de sérum de chèvre réalisée en immunohistochimie sur fond clair. Incuber les lames dans l'anticorps primaire dilué dans 0,75% Triton X-100 dans du PBS pendant deux heures à 37 ° C. Appliquer la solution d'anticorps primaire directement en haut de diapositives et incuber en chambre humide pour éviter l'évaporation. Ne contiennent pas de sérum dans l'une quelconque des antisolutions corps n'utiliser que du PBS et Triton X-100. Laver les lames dans du PBS trois fois chacune pendant 10 minutes. Incuber en anticorps secondaire pendant une heure à température ambiante et à protéger les lames de lumière. Centrifuger tous les anticorps fluorescents secondaires pendant 20 minutes pour éviter les agrégats de pénétrer dans la solution d'anticorps. Préparer des dilutions d'anticorps en utilisant 0,75% de Triton X-100 dans du PBS. Laver les lames dans du PBS trois fois chacune pendant 10 minutes. Tremper les lames une fois dans de l'eau distillée pour rincer les sels de PBS. Diapositives sécher une nuit à température ambiante, couvert abri de la lumière. Lamelle glisse avec ProLong médias Antifade. Composante A dégel au micro-ondes pendant 5-10 secondes et ajouter environ 1 ml d'un flacon de composant B. Mélanger à l'aide d'une pipette Pastuer, en faisant attention de ne pas introduire de bulles d'air dans la solution. Centrifuger pendant 5 min à vitesse maximale pour éliminer les bulles. Appliquer une fine couche de prolonger le programme MEDIA en haut de la lame à l'aide d'une pipette Pastuer, attention à ne pas créer de bulles d'air. Placez délicatement lamelle sur le dessus de la glissière et sécher pendant la nuit, couvert abri de la lumière. Double immunocoloration étiquette fluorescente (figure 5). Effectuer fluorescente Immunostaining comme décrit ci-dessus, à l'exception diluer les anticorps primaires dans la même solution d'incubation. Diluer tous les anticorps secondaires dans la même solution et incuber comme décrit ci-dessus. Périodes d'incubation série utilisant deux anticorps a entraîné une diminution immunomarquage. 13. Les résultats représentatifs Figure 1. Apparence des cultures tranche d'hippocampe et la microglie. L'image de gauche montre une mature type (c.-à 21 jours in vitro) la culture tranche hippocampique tache avec NeuN (vert) pour illustrer la cytoarchitecture des neurones principaux. Les neurones pyramidaux sont indiqués dans les zones CA1 et CA3 et de la Dentmangé gyrus (DG) des neurones vers la gauche. La barre d'échelle est de 250 um. L'image de droite est extraite de la zone CA1 et représenté à une puissance plus élevée pour illustrer la qualité de la microglie ramifiée dans les cultures de tranches de repos matures. Les cellules ont été marquées avec le marqueur de surface des microglies, CD11b. La barre d'échelle est de 50 um. Figure 2. Froid préconditionnement neuroprotection dans les cultures tranche d'hippocampe. Les cultures sont incubées avec Sytox Green, un marqueur fluorescent marqué cellules mortes. La rangée du haut montre cultures témoins fictifs et la rangée du bas montre les tranches exposées à 28 ° C pendant 90 min. La main gauche, la présélection des images ne montrent pas de blessures CA1. Relative échelle de calibrage blessures couleur est montré dans l'image en haut à gauche. Images rangée du milieu montrent relativement blessures culture tranche de 24 heures après l'exposition à 20 uM NMDA. Notez que le contrôle des blessures trompe-l'oeil est supérieure à celle des cultures exposées à froid PRECONDitioning (CP). Traditionnellement, les cultures sont ensuite exposés à 20 uM NMDA nuit pour maximiser CA1 niveaux de blessures neuronales et les blessures relative de CP c imposture, a noté que le rapport de blessure / accident maximal. Toutefois, l'exposition à des stimuli blessures maximal peut ne pas être suffisante pour surmonter la neuroprotection de préconditionnement. En conséquence, l'utilisation de ratios de blessures / lésions maximale peut ne pas refléter la neuroprotection de préconditionnement. Cela est évident dans les images de droite montrent que les niveaux maximaux CP sont inférieurs à ceux des témoins fictifs. Figure 3. Schéma illustrant l'utilité d'utiliser des mesures initiales, la première journée de quantifier les niveaux de blessures au froid préconditionnement expériences. Comme indiqué ci-dessus, nous avons constaté que l'utilisation de ratios (blessure / accident maximal) pourrait occulter la neuroprotection à froid, pré-conditionnement. Ceci peut être vu à partir du schéma vers la gauche où shh blessure est affiché en rouge et que, après froid préconditionnement en bleu. Un jour, après exposition au NMDA froid préconditionnement montre une relative "3" niveau de la lésion v feinte ("5") de contrôle, conformément à la neuroprotection 40%. Toutefois, si un format traditionnel en utilisant des ratios (par exemple, accident / blessure maximale) est utilisé, aucune protection est évident [à savoir, (5/10) = 50% pour imposture v (3/6) = 50% à froid préconditionnement ]. Figure 4. Typial résultat qPCR sont affichés. Numéro Upper copie courbe ARN v cycle seuil pour l'amplification PCR montrant les commandes (en bleu) et des échantillons expérimentaux (rouge). Image du bas montre les profils d'amplification typiques pour quatre échantillons (noir, vert, jaune et violet). Remarquez les derniers cycles de seuil Ct (marquée par la ligne orange) se produisent à 26,0, 29,5, 31,0, et 32,5. Figure 5. Matle-étiquette immunomarquage permet de confirmer les résultats de réseau et qPCR qPCR Une culture de section a été générée pour l'IL-11 (rouge) et NeuN (vert, pour marquer les neurones). pour sonder les loci d'expression cellulaire de l'IL-11. Notez que certains neurones pyramidaux (flèches) montrent l'IL-11 et de la coloration NeuN (jaune), tandis que quelques cellules plus petites (flèches), censés être les astrocytes, montrent que l'IL-11 a augmenté de coloration (rouge).