Blu nativi poliacrilammide gel elettroforesi (BN-PAGE) per l'analisi di complessi multiproteici da lisati cellulari

** Questo protocollo video si basa su una pubblicazione associata 1: blu nativi elettroforesi su gel poliacrilammide (BN-PAGE) per l'identificazione e l'analisi di complessi multiproteici. Mahima Swamy, Gabrielle M. Siegers, Susana Minguet, Bernd Wollscheid, e Wolfgang WA Schamel. Scienza STKE 2006 (345): PL2, 25 luglio 2006, [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Clicca qui per vedere questa pubblicazione . 1. Preparazione del lisato cellulare dializzati Harvest 10×10 6 celle e pellet da centrifugazione a 350g per 5 minuti a 4 ° C. Lavare il pellet di cellule per tre volte con 1 ml di PBS ghiacciato (ricetta 1), centrifuga come al punto 1.1. Risospendere il pellet in 250 ml di ghiacciata BN-Lysis Buffer (ricetta 2) e incubare in ghiaccio per 15 minuti. Centrifugare a 13.000 g per 15 minuti a 4 ° C per rimuovere il materiale insolubile. Sciogliete un foro nel tappo di un 1,5 mL provetta utilizzando il lato riscaldato di grande diametro di una pipetta Pasteur, quindi inserire la provetta in ghiaccio per raffreddare a 4 ° C. Trasferire il surnatante dal passo 1,4 nel tubo raffreddato con il foro nel tappo. Inserire una membrana di dialisi (peso molecolare di cut-off di 10 kD) con una pinza sulla parte superiore del tubo aperto, chiudere il tappo, e tagliare l'eccesso di membrana di dialisi che sporge. Sigillare il tappo sul lato accuratamente con Parafilm. Invertire i tubi e centrifugare a testa in giù alla velocità più bassa possibile in una provette coniche da 50 ml in una centrifuga di coltura cellulare per 10 secondi a 4 ° C. Rimuovere il tubo invertito dalla centrifuga con una pinzetta per evitare di trasformare la parte destra del tubo alto. Preparare un becher da 100 ml con freddo BN-Dialisi Buffer (ricetta 3) e un piatto mescolate. Utilizzare almeno 10 ml di BN-dialisi-Buffer per 100 microlitri del campione. Fissare il tubo con del nastro adesivo a testa in giù dentro il bicchiere, e rimuovere le bolle d'aria dal foro sotto il tappo con una pipetta Pasteur piegato. Bicchiere posto sulla cima di un agitatore magnetico, accendere l'agitatore e lasciare per 6 ore o una notte in cella. Controllare di tanto in tanto per garantire che mescolando non è la creazione di bolle d'aria a livello della membrana di dialisi. Raccolgono il lisato cellulare dializzati in un tubo nuova microcentrifuga refrigerata. 2. Versamento di BN-gel Gel gradiente colata avviene a temperatura ambiente con un mixer gradiente. I guanti devono essere indossati perché poliacrilammide è un potente neurotossico. Evitare qualsiasi contatto con SDS. Posizionare il mixer gradiente su un piatto mescolare e allegarlo a un pezzo di tubo flessibile. Chiudere il canale utilizzando la valvola e chiudere il tubo con una fascetta. Posizionare un agitatore magnetico del 15% nel cilindro "alto" collegato al tubo. Infilare il tubo flessibile in una pompa peristalitic e inserire un ago siringa fino alla fine. Poi, posto l'ago tra le due lastre di vetro dell'apparato gel. Preparare 4% (ricetta 5) e 15% (ricetta 6) che separa le soluzioni gel, l'aggiunta di APS e TEMED immediatamente prima dell'uso. I volumi combinati dovrebbe essere pari al volume del gel di separazione. Versare queste soluzioni gel nei cilindri corrispondente del mixer pendenza (4% nel "basso" e il 15% nel cilindro "alto"). Aprire la valvola e la forza fuori la bolla d'aria all'interno del canale che collega i due serbatoi in gel premendo sul cilindro sinistro con il pollice. Accendere l'agitatore magnetico, rimuovere la pinza, e accendere la pompa peristalitic a 5 ml al minuto. Lasciare che il gel di fluire lentamente tra le lastre di vetro. Assicurarsi che l'ago sia sempre al di sopra del liquido. Lasciare tutto il liquido di inserire l'apparato gel, e poi sovrapporre delicatamente con isopropanolo. Lasciare polimerizzare il gel per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. Pulire l'apparato versando immediatamente con dH 2 O (non usare detergenti). Rimuovere l'isopropanolo, lavare con dH 2 O, e rimuovere il dH 2 O con una carta Whatman. Preparare un gel 3,2% accatastamento (ricetta 7), l'aggiunta di APS e TEMED immediatamente prima dell'uso. Versare il gel di impilamento sulla parte superiore del gel di separazione e di introdurre il pettine tra le lastre di vetro, evitando le bolle. Dopo che il gel di impilamento è polimerizzato, il gel fresco fino a 4 ° C. Immediatamente prima del caricamento del campione, rimuovere lentamente il pettine, tirando fuori un angolo rispetto al piano del gel. Questo permette all'aria di entrare rapidamente nelle tasche, che migliora la qualità dei pozzi. 3. Separazione di lisato cellulare dializzati da BN-PAGE Carico 1-40 ml di lisato dializzato e da 10 a 20 l di Mix Marker (ricetta 10) nei pozzi a secco a 4 ° C. Sovrapposizione dei campioni in ogni pozzetto con tampone di catodo freddo (ricetta 8). Riempire la camera interna con Cat freddonell'hode stabilizzatrice e la camera esterna / inferiore con Buffer anodo freddo (ricetta 9). Applicare 100 V ad un minigel o 150V per un gel di grandi dimensioni, fino a quando i campioni sono entrati nel gel di separazione. Attivare il gel a 4 ° C. Aumentare la tensione a 180 V (minigel) o 400 V (gel di grandi dimensioni) ed eseguire fino a quando il fronte del colorante raggiunge la fine del gel. La corsa dura da 3 a 4 ore per un mini-, e da 18 a 24 ore per un gel di grandi dimensioni. 4. Seconda dimensione SDS-PAGE Preparare uno standard di 10% SDS-gel (ricette 12-15) con una sola corsia di grandi dimensioni per la prima dimensione BN-PAGE corsia, una corsia regolare per il marcatore di peso molecolare, e una corsia regolare per un aliquota del lisato dializzati che ha stato mescolato con tampone campione SDS (ricetta 11) e bollite per 5 min a 95 ° C. Utilizzare distanziatori il cui spessore è stato aumentato da due strati di nastro adesivo per semplificare il caricamento della BN-PAGE fetta gel sul gel SDS. Rimuovere il BN-PAGE gel nei piatti dall'apparato elettroforesi e sollevare delicatamente alto di una lastra. Rimuovere il gel di impilamento e tagliare fuori la corsia del BN-PAGE gel contenenti le proteine ​​di interesse. Posizionare il BN-PAGE fetta gel nel tampone 2x SDS campione e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Far bollire il BN-PAGE brevemente fetta gel (non più di 20 sec) in un forno a microonde. Incubare la BN-PAGE fetta gel nel caldo Sample Buffer SDS per altri 15 min a temperatura ambiente. Caricare il BN-PAGE fetta gel nella grande ben oltre il gel di sovrapposizione del SDS-PAGE gel evitando bolle d'aria, e sovrapporre la fetta con Sample Buffer SDS. Carico marcatore e controllo lisato. Eseguire l'elettroforesi secondo protocolli standard. 5. Rilevazione di subunità MPC mediante immunoblotting Per il trasferimento, preparare sei documenti Whatman e una membrana PVDF adattamento alle dimensioni del SDS-gel. Incubare la membrana PVDF in 100% di metanolo per 30 s e godersi le carte Whatman nel buffer di trasferimento (ricetta 16). Inserire tre carte Whatman, la membrana PVDF, la SDS-gel (rimuovere stacking gel), e di nuovo tre carte Whatman in una struttura a sandwich in una cella trasferimento semisecco. Applicare 20 V per 25 min. Rilevare le proteine ​​secondo i protocolli standard di immunoblotting. 6. Rappresentante Risultati Vi presentiamo l'analisi del 19S eucariotiche, 20S e 26S proteasomi come esempio per la caratterizzazione dei MPC da 2D BN / SDS-PAGE (Figura 1A). HEK293 cellule sono state lisate con un tampone contenente 0,1% Triton X-100 come un detersivo per distruggere le membrane e solubilizzare complessi di proteina di membrana. Queste lisati sono stati dializzati contro BN-dialisi buffer per eliminare i sali e metaboliti di piccole dimensioni. Poi, PPM erano separati da 4-15% gradiente BN-PAGE seguita da una seconda dimensione SDS-PAGE. Le proteine ​​sono state visualizzate mediante immunoblotting con anticorpi contro la subunità β2 e Mcp21 del proteasoma 20S. Figura 1. Un approccio bidimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE utilizzando lisati cellulari. (A) diagramma di flusso di un approccio BN-PAGE/SDS-PAGE 2D da lisati cellulari. (B) schema schematica di un BN-PAGE/SDS-PAGE 2D. Proteine ​​e PPM sono separati in condizioni native da BN-PAGE in una prima dimensione. Per la seconda dimensione, le proteine ​​e / o PPM vengono denaturate dal SDS nella striscia di gel dopo la separazione da BN-PAGE e successivamente sottoposti a SDS-PAGE. Proteine ​​monomeriche migreranno in una causa iperbolico diagonale per il gel gradiente nel primo e un gel lineare nella seconda dimensione. Componenti di una concreta MPC sarà trovato sotto la diagonale, che si trova su una linea verticale. E 'stato dimostrato che dalla combinazione di prima dimensione BN-e seconda dimensione SDS-PAGE, proteine ​​monomeriche migrare all'interno di un diagonale iperbolica a causa del gradiente di gel nel primo e il gel lineare nella seconda dimensione ((Camacho-Carvajal, Wollscheid et al 2004);. Figura 1B). I componenti di PPM si trovano sotto questa diagonale. Proteine ​​che rappresentano subunità della stessa MPC può essere trovato in una linea verticale nella seconda dimensione, mentre diversi punti della stessa proteina in una linea orizzontale indicano la presenza della proteina in diversi PPM distinte. La Figura 2 mostra che nel nostro esperimento immunoblotting contro β2 e Mcp21 rivelato la presenza di complessi proteici specifici contenenti tali subunità del proteasoma. Entrambe le proteine ​​erano rilevabili come punti singoli disposti in linea orizzontale, ad indicare che β2 e Mcp21 rappresentano costituenti di diversi PPM distinte. Questi PPM potrebbe essere chiaramente identificato come il proteasoma 26S (20S 19S più tappo), il proteasoma 20S insieme alla subunità regolatrice PA28, e il 20S proteasomi da solo, sulla base della loro dimensione e composizione. Presi insieme, questi resuLTS dimostrare che MPC endogena può essere identificato e caratterizzato da un approccio bidimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE con lisato cellulare. Questo metodo è applicabile per la determinazione della dimensione, composizione e abbondanza relativa di PPM. Figura 2. Dell'individuazione di forme diverse del proteasoma eucarioti mediante immunoblotting dopo bidimensionale BN-PAGE/SDS-PAGE. Per l'identificazione e l'analisi dei proteasomi eucariotiche, HEK293 cellule sono state lisate con 0.1% Triton X-100. Lisati cellulari sono stati dializzati e successivamente sottoposti a BN-PAGE (4-15%) di PPM separati. In seguito, una seconda dimensione SDS-PAGE (10%) è stato eseguito per la separazione delle sottocomponenti dimensione individuale. Immunoblotting è stata effettuata con anticorpi specifici riconoscendo il Mcp21 e β2 subunità del complesso nucleo 20S, e per la subunità regolatrice PA28. Tabella I. di reagenti specifici (ordine alfabetico): Reagente Azienda Commenti 6-aminohexanoic acido (Ε-aminocaproico acido) Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania Questo prodotto chimico è un irritante e deve essere maneggiato con i guanti. Acrilamide-bisacrylamide soluzione (40%), miscela 32:1 Applichem, Darmstadt, Germania Questa soluzione è neurotossico e deve essere maneggiato con i guanti. Bis-tris Roth, Karlsruhe, Germa-ny Brij 96 Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania Coomassie blu G250 Serva, Heidelberg, Ger-mania Non sostituire altri tipi di Coomassie colorante Coomassie blu come R250 o colloidale Coo-Massie blues. Digitonina Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania Digitonina è tossico. Dovrebbero indossare guanti protettivi quando si maneggiano i buffer o campioni contenenti questo detersivo. Dodecylmaltoside Applichem, Darmstadt, Germania Triton X-100 Roth, Karlsruhe, Germa-ny Triton X-100 è tossico. Dovrebbero indossare guanti protettivi quando si maneggiano tamponi o campioni contenenti questo detergente. II. Tabella di materiale e attrezzature specifiche: Attrezzatura Azienda Membrane di dialisi (peso molecolare di cut-off 10-50 kD) Roth, Karlsruhe, Germania Gel elettroforesi sistema Per esempio da Bio-Rad, Monaco di Baviera, Germania Gradiente mixer Self-made o disponibili in commercio da Bio-Rad, Monaco di Baviera, Germania Pompa peristaltica Amersham Pharmacia Biotech, Friburgo, Germania Polivinilidene fluoruro (PVDF), membrana Immobilon-P, Millipore, Eschborn, Germania Semisecco trasferimento attrezzature Per esempio da Bio-Rad, Monaco di Baviera, Germania Silicon tubing (3 a 5 mm di diametro, 1 m di lunghezza) NeoLab, Heidelberg, Germania III. Tabella di ricette: No. Tamponi e soluzioni Contenuto Commenti 1 Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) Na 2 HPO 4 8,1 mMKH 2 PO 4 1.5 mM NaCl 138 mm KCl 2,7 mm Soluzione deve essere pH 7,4, se preparate correttamente. 2 BN-Lysis Buffer Base di buffer Bis-Tris 20 mM ε-aminocaproico acido 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8.0 2 mM Glicerolo 10% Regolare il pH a 7,0 con HCl. Conservare a 4 ° C. Detergente Digitonina 0,5-1,0% o Brij 96 0,1 allo 0,5% o Triton X-100 0,1 allo 0,5% o Dodecylmaltoside 0,1 allo 0,5% Inibitori della proteasi e fosfatasi Aprotinina 10 mcg / mL Leupeptina 10 mcg / mL PMSF 1 mM Fluoruro di sodio 0,5 mM Sodio orthovanadate 0,5 mM Il detersivo appropriato deve essere determinato in modo empirico dovrebbe essere lo stesso di quello usato nelle ricette altre tampone di lisi. Digitonina devono essere aggiunti al momento dell'uso da una soluzione di riserva del 2% dH 2 O (negozio in 5 ml aliquote a -20 ° C). Proteasi e fosfatasi inibire-ORS deve essere aggiunto immediatamente prima dell'uso. Dopo l'aggiunta di sodio orthova-nadate, il buffer diventa di colore giallastro. 3 BN-dialisi Buffer Base di buffer Bis-Tris 20 mM ε-aminocaproico acido 500 mM NaCl 20 mM EDTA, pH 8.0 2 mM Glicerolo 10% Regolare il pH a 7,0 con HCl. Conservare a 4 ° C. Detergente Digitonina 0,3-0,5% o Triton X-100 0,1% o Brij 96 0,1% o Dodecylmaltoside 0,1% Inibitori della proteasi e fosfatasi PMSF 1 mM Sodio orthovanadate 0,5 mM Il detersivo appropriata deve essere determinata empiricamente e dovrebbe essere lo stesso di quello usato nel buffer di lisi, ma al più basso indicato concentrazioni di. Detergente deve essere aggiunto al pre-sfogo di aggregazione nella fase di sovrapposizione dei elettroforesi su gel. Proteasi e fosfatasi inibire-ORS deve essere aggiunto immediatamente prima dell'uso. 4 3x BN-Gel Buffer Bis-Tris 150 mM ε-aminocaproico acido 200 mM Regolare il pH a 7,0 con HCl. Conservare a 4 ° C. 5 4% gel separatore 3x BN-Gel Buffer (ricetta 4) 5,00 ml Acrilamide / Bisacrylamide 1,50 ml dH 2 O 8,50 ml APS, il 10% in DH 2 O 54 microlitri TEMED 5,4 microlitri Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione. Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato. 6 15% gel separatore 3x BN-Gel Buffer (ricetta 4) 5,00 ml Acrilamide / Bisacrylamide 5,63 ml Glicerolo 70% 4,38 ml APS, il 10% in DH 2 O 42 microlitri TEMED 4,2 microlitri Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione. Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato. La concentrazione di acrilamide-bisacrylamide può anche essere variata, se necessario 10-18%. 7 3,2% Stacking Gel 3x BN-gel Buffer (ricetta 4) 3,00 ml Acrilamide / Bisacrylamide 0,72 ml dH 2 O 5,28 ml APS, il 10% in DH 2 O 120 microlitri TEMED 12 microlitri Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione. Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato. 8 Catodo Buffer Bis-Tris 15 mM Tricine 50 mM Coomassie blu G250 0,02% Preparare 1 litro come uno stock 10x, aggiustare il pH a 7.0 con HCl, e conservare a 4 ° C. Diluire 1:10 con dH 2 O prima dell'uso. Non sostituire altri tipi di colorante Coomassie come Coomassie R250 blu o blu Coomassie colloidale. 9 Buffer anodo Bis-Tris 50 mM Preparare 1 litro come uno stock 10x, aggiustare il pH a 7.0 con HCl, e conservare a 4 ° C. Diluire 1:10 con dH 2 O prima dell'uso. 10 Marker Mix Aldolasi (158 kD) 10 mg / mL Catalasi (232 kD) 10 mg / mL Ferritina (440 e 880 kD) 10 mg / mL Tireoglobulina (670 kD) 10 mg / mL BSA (66 e 132 kD) 10 mg / mL Bis-Tris 20 mM NaCl 20 mM Glicerolo 10% Regolare il pH a 7,0 con HCl. Conservare a 4 ° C. Marcatori peso molecolare sono anche disponibili in commercio da diverse fonti, tra cui Invitro generazione o Pharmacia. 11 SDS campione Tampone Tris 12,5 mm SDS 4% Glicerolo 20% Blu di bromofenolo 0,02% Regolare il pH a 6,8. Per ridurre i ponti disolfuro, aggiungere 9 ml β-mercaptoetanolo. SDS come polvere e β-mer-captoethanol sono tossici. Pertanto, utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa. 12 4x tampone inferiore Tris 1,5 M SDS 0,4% Regolare il pH a 8,8. SDS come polvere è tossico. Pertanto, utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa. 13 4x tampone superiore Tris 0,5 M SDS 0,4% Regolare il pH a 6,8. SDS come polvere è tossico. Pertanto, utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa. 14 10% gel separatore Acrilamide (30%) 2,0 ml Inferiore tampone 4x 1,5 ml dH 2 O 2,454 ml APS, il 10% in DH 2 O 40 microlitri TEMED 6 microlitri Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione. Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato. 15 4,8% Stacking Gel Acylamide (30%) 320 microlitri 4 volte superiore di buffer 500 microlitri dH 2 O 1,16 ml APS, il 10% in DH 2 O 20 l TEMED 2 microlitri Aggiungi APS e TEMED riconoscibili ad occhio nudo prima di versare gel, in quanto questi reagenti promuovere la polimerizzazione. Questa ricetta è sufficiente per lanciare un 30 ml di gel. Regolare i volumi per il numero e le dimensioni del gel viene versato. 16 Semisecco Transfer Buffer Tris 48 mm Glycine 39 mm Metanolo 20% SDS 0,1% Regolare il volume a 1 litro con dH 2 O. Conservare a temperatura ambiente. SDS come polvere e metanolo sono tossici. Pertanto, utilizzare guanti e lavorare sotto una cappa.