Electroeluting fragmentos de ADN

Para la selección de fragmentos de ADN de interés para ser purificados, estos deben ser resueltos en geles de agarosa o acrilamida gel teñido con bromuro de etidio por electroforesis en buffer TBE 0.5X (Tris borato, EDTA) a 120 voltios durante 1 hora. Para ello, unos 700 ng de plásmido pProEx-GdMre11S (6000-pb) previamente digerido con NdeI y HindIII fue utilizada para liberar un fragmento de 900 pb (560 ng de plásmido y 84 ng del fragmento). El tanque de electroeluter (Figura 1) debe ser llenado con TBE 0.5X distribuye por igual en cada lado de la meseta a mediados cuidando de no derramar en la meseta intermedia. La banda seleccionada (o bandas) es cortada del gel, y se coloca en la cámara de muestras lo más cerca posible al canal V (una rebanada por pozo). Funcionamiento de amortiguación se debe agregar a cada grupo; lo suficiente para cubrir la porción de gel. Cada canal V utilizados deben ser eliminados con una pipeta Pasteur para eliminar cualquier burbuja de aire atrapada. De 100 ul de 10 M NH 4 acetato (para facilitar la visualización de una pequeña cantidad de azul de bromofenol se añade, justo lo suficiente para que el color) se añadió con suavidad dentro del canal V. La tapa deberá estar cerrada con cuidado para evitar la resuspensión del colchón de sal. Electroelución se inicia a 100 voltios durante 25 minutos. Cuando se haya completado electrolution, 400 ul se retiran de V-canal, y se coloca en un tubo de microcentrífuga que se precipitó con 2 volúmenes de etanol frío y el glucógeno (recomendado para mejorar la recuperación de ADN) a 4 ° C durante 1 hora o toda la noche. Centrifugar durante 20 minutos, retirar el sobrenadante y lavar con etanol al 70%. Tubo seco y cuantificar el ADN a OD 260 nm. La recuperación obtenida fue del 75% (63 ng recuperado 84 ng cuando fueron colocados en la V-canal). Figura 1. Diagrama Electroeluter. Anod un cátodo se indican en cada lado del tanque, el ADN contenido en gel en rodajas (ilustrado como un cuadrado negro) migrarán hacia el cátodo, debido a su carga negativa. Entonces será atrapado en el cojín de la sal (representado como un triángulo negro invertido), ubicado en la V-canal.