Questa procedura permette la purificazione di frammenti di DNA con alto rendimento.
Frammenti di DNA purificati vengono utilizzati per scopi differenti in Biologia Molecolare e possono essere preparati con procedure diverse. La maggior parte di essi richiedono una precedente elettroforesi dei frammenti di DNA al fine di separare la banda di interesse. Poi, questa band è escisse fuori da un gel di agarosio o acrilamide e purificate utilizzando: vincolanti e eluizione di particelle di vetro o di silice, DEAE-cellulosa membrane, "cotta e immergere metodo", electroelution o molto spesso costosi kit di purificazione commerciale. Così, la selezione di un metodo dipende per lo più di ciò che è disponibile in laboratorio. La procedura electroelution permette di purificare il DNA molto pulito per essere utilizzato in un gran numero di applicazioni (sequenziamento, radiomarcatura, restrizione enzimatica, modificazione enzimatica, ecc clonazione). Questa procedura consiste nel mettere DNA banda contenenti fette di agarosio o acrilamide nei pozzetti campione del electroeluter, allora in corso l'applicazione farà il frammento di DNA di lasciare l'agarosio e quindi essere intrappolati in un sale cuscino da recuperare in seguito dalla precipitazione dell'etanolo.
La durata della corsa dipenderà fortemente dalle dimensioni dei frammenti, normalmente per frammenti fino a 20 kb 50 minuti a 1 ora è sufficiente, mentre per i piccoli frammenti di luce UV monitoraggio ogni 10 minuti è necessaria per evitare il frammento di passare attraverso il cuscino di sale e di conseguenza alla camera di buffer di anodica diminuzione di recupero. E 'importante assicurarsi che quando si imposta l'alimentazione a 100 volt, c'è una corrente di almeno di 10 mAmp. La banda del DNA può essere monitorato tramite una lampada UV-mano e rilevare quando questa abbandona la fetta gel. Il sale cuscino può essere fatta anche con 3 M Na acetato.
Questa procedura permette la purificazione di frammenti di DNA o RNA di diverse dimensioni con un buon recupero (~ 80%) da radiomarcato, digerito dagli enzimi di restrizione, trattati con enzimi che modificano, ecc
The authors have nothing to disclose.
Lavoro in Dr. Bermudez laboratorio è stato finanziato dalla Conacyt (Grant # 82622). Ringraziamo Gabriela Gutierrez-Sosa, Eliuth Reyes-Martinez e Ximena Rodriguez-Torres per la registrazione video della procedura electroleution.
Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NdeI | New England Biolabs | R0111L | ||
HindIII | New England Biolabs | R0104L | ||
NH4 acetate | JTBaker | 0596 | ||
agarose | Invitrogen | 15510-027 | ||
Biophotometer | Eppendorf | 6131 000 020 | ||
Electroeluter | IBI | UEA CAT 46000 |