In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali
Özet
Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.
Abstract
Studio in vitro su colture primarie neuronali permette di analisi quantitative di crescita dei neuriti. Al fine di studiare come le alterazioni genetiche influenzano escrescenza processo neuronale, shRNA o costrutti del DNA può essere introdotto in neuroni primari tramite trasfezione chimici o trasduzione virale. Tuttavia, con primarie cellule corticali, un pool eterogeneo di tipi di cellule (neuroni glutamatergica da diversi strati, neuroni inibitori, cellule gliali) sono transfettate con questi metodi. L'uso di elettroporazione in utero ad introdurre i costrutti del DNA nella corteccia roditori embrionale permette di alcuni sottoinsiemi di cellule su cui agire: mentre elettroporazione dei primi strati embrionali obiettivi corteccia profonda della corteccia, elettroporazione a tarda timepoints embrionale obiettivi strati più superficiali. Inoltre, il posizionamento differenziale di elettrodi sulle teste dei risultati della singola embrioni nel individuazione delle regioni dorso-ventrale mediale contro-laterale della corteccia. A seguito di elettroporazione, le cellule trasfettate possono essere asportate, dissociato, e placcato in vitro per l'analisi quantitativa di crescita dei neuriti. Qui, forniamo un passo-passo metodo per misurare quantitativamente escrescenza neuronale processo in sottoinsiemi di cellule corticali.
Il protocollo di base per l'elettroporazione in utero è stato descritto in dettaglio nei due articoli JOVE altri dal laboratorio Kriegstein 1, 2. Vi forniremo una panoramica del nostro protocollo di elettroporazione in utero, concentrandosi sui dettagli più importanti, seguita da una descrizione del nostro protocollo che si applica videodan elettroporazione utero allo studio della funzione dei geni nella crescita processo neuronale.
Protocol
Discussion
Studio in vitro su colture primarie neuronali consentono di analisi quantitative di crescita dei neuriti. Al fine di studiare come le alterazioni genetiche influenzano escrescenza processo neuronale, costrutti shRNA o misexpression può essere introdotto in neuroni primari tramite trasfezione chimici o trasduzione virale. Tuttavia, con primarie cellule corticali, un pool eterogeneo di tipi di cellule (neuroni glutamatergica da diversi strati, neuroni inibitori, cellule gliali) sono transfettate con questi metod…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Giuseppe LoTurco e Dennis Selkoe per le discussioni utili su questa tecnica. Gli autori ringraziano i donatori della Fondazione Americana Assistenza Sanitaria, per il supporto di questa ricerca.
Materials
| Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cortical Neuron Preparation | ||||
| Dissection Media: | ||||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (Ca+2 /Mg +2 free) | Gibco | 14185-052 | ||
| 10X Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) (with Ca+2 /Mg +2 ) | Gibco | 14065-056 | ||
| 1M HEPES pH 7.4 | Gibco | 15630-080 | ||
| Dishes and Vials: | ||||
| 100 x 15 mm Petri Dishes | Fisherbrand | 08-757-12 | ||
| 60 x 15 mm Petri Dishes | BD Falcon | 351007 | ||
| 15 mL conical vial | Sarstedt | 62-547-205 | ||
| 50 mL conical vial | Sarstedt | 62-554-205 | ||
| Dissection Tools: | ||||
| Scissors | Fine Science Tools | 91402-12 | ||
| Standard Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | ||
| Curved Forceps | Fine Science Tools | 11273-20 | ||
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | ||
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Miscellaneous: | ||||
| .25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | ||
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Hausser Scientific | 1490 | ||
| Hand-Held Tally Counter | Sigma | Z169021 | ||
| Plating Medium: | ||||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (D-MEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | ||
| Growth Medium: | ||||
| NEUROBASAL Medium | Gibco | 21103-049 | ||
| B-27 Serum-Free Supplement | Gibco | 17504-044 | ||
| GlutaMAX -I Supplement | Gibco | 35050-061 | ||
| Gentamicin Reagent Solution | Gibco | 15750-060 | ||
| Immunostaining: | ||||
| Fixative, Washes, and Blocking Buffer: | ||||
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | P4417 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
| Donkey Serum | Jackson Immuno | 017-000-121 | ||
| Antibodies: | ||||
| beta-III tubulin antibody | Chemicon | MAB1637 | ||
| MAP2 antibody | Chemicon | AB15452 | ||
| Donkey Cy3 anti-mouse | Jackson Immuno | 715-166-151 | ||
| Donkey Cy2 anti-chicken | Jackson Immuno | 703-226-155 | ||
| DAPI | Gibco | D3571 | ||
| Slide Preparation: | ||||
| CC2 Coated Two-Chamber Slides | Lab-Tek | 154852 | ||
| Fluorescent Mounting Media | KPL | 71-00-16 | ||
| 24 x 60 mm Micro Cover Glasses | VWR | 48393-106 | ||
| Clear nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | ||
| Electroporation: | ||||
| Ketamine | Henry Schein | 995-2949 | ||
| Xylazine | Henry Schein | 4015809TV | ||
| buprenorphine | Henry Schein | 1118217 | ||
| Picospritzer III | Parker | |||
| BTX square wave electroporator | Fisher | BTXECM830 | ||
| Tweezertrodes, 7 mm, platinum | Harvard Apparatus | 450488 |
Referanslar
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E16 rat embryos. J Vis Exp. , (2007).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70 (4-5), 155-1562 (2002).
- Bai, J., Ramos, R. L., Ackman, J. B., Thomas, A. M., Lee, R. V., LoTurco, J. J. RNAi reveals doublecortin is required for radial migration in rat neocortex. Nat Neurosci. , 1277-1283 (2003).
- Okada, A., Lansford, R., Weimann, J. M., Fraser, S. E., McConnell, S. K. Imaging cells in the developing nervous system with retrovirus expressing modified green fluorescent protein. Exp Neurol. 156 (2), 394-406 (1999).
- Bai, J., Ramos, R. L., Paramasivam, M., Siddiqi, F., Ackman, J. B., LoTurco, J. J. The role of DCX and LIS1 in migration through the lateral cortical stream of developing forebrain. Dev Neurosci. , 144-156 (2008).
- Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nat Rev Neurosci. , 427-437 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Bai, J., Chang, R., Zheng, J. B., Loturco, J. J., Selkoe, D. J. A Critical Function for -Amyloid Precursor Protein in Neuronal Migration Revealed by In Utero RNA Interference. J Neurosci. 27, 14459-14469 (2007).
- Young-Pearse, T. L., Chen, A. C., Chang, R., Marquez, C., Selkoe, D. J. Secreted APP regulates the function of full-length APP in neurite outgrowth through interaction with integrin beta1. Neural Develop. 3, 15-15 (2008).
