שיטה בידוד איילט Murine והשתלות כליה Subcapsular

1. הכנה כיול מגיב Liberase פרוטוקול זה מנצל Liberase TL (רוש, חתול # 05 401 020 001) אנזים לעיכול הלבלב. רכש 100-200mg בכל פעם ולעשות אצווה גדול. Re-להשעות אבקת lyophilized במים HPLC סטרילי כיתה כך הריכוז הוא כ 26 יחידות וונש לכל מ"ל. זה צריך להיות בערך 5 מ"ג / מ"ל. ראו את העלון לקבלת פרטים על יחידות וונש הכלול במגרש מסוים. מניחים צלוחיות על קרח במשך 30 דקות עם גוי מתערבל כל כמה דקות. בדוק כדי להבטיח אבקת מתמוסס לחלוטין בסוף 30 דקות. בריכת כל Liberase מומס ומערבבים יחד עם מתערבל עדין (אל מערבולת או לנער). 24.3 Aliquot וונש יחידות מראש צונן צינורות Eppendorph, הקפאה מהירה על חנקן נוזלי (להתייחס אליו כאל כל אנזימים) ולאחסן ב -80 ° C. זה צריך להיות כ 0.935ml לכל צינור Eppendorph. Aliquot כל אחד לשימוש (מספיק ל 11 עכברים) ולא צריך להיות מאוחסן או מחדש קפוא מופשר פעם. באופן כללי, המניה יציבה במשך לפחות 6 חודשים. עבור כל אצווה חדשה, לכייל את זמן הדגירה אופטימלית. השתמש מניות קפואים, לא המניות מומס טרי, לצורך כיול, לחקות את תנאי הניסוי אמיתי ככל האפשר. כייל את האמבטיה במים אתה מתכוון להשתמש בדיוק 37 ° C באמצעות מדחום כספית. השתמש באותה חממה בניסויים עתידיים. לפני השימוש, להפשיר צינור של Liberase על הקרח ולהוסיף אותו (0.935ml) כדי 21.6ml בסרום חינם RPMI, מה שהופך את ריכוז העבודה הסופית 1.08 יחידות וונש לכל מ"ל. סרום, BAS ו EDTA לעכב Liberase. אבץ וסידן הם cofactors. חנות על הקרח ושימוש בתוך 1.5 שעות. זה מספיק כ 11 עכברים (2ml/mouse). ראה שלב 2.3 עבור זלוף הלבלב. Perfuse כמו עכברים רבים ככל האפשר בתוך שעה 1. ואז להשתמש באחד או שניים עכברים עבור כל פעם הדגירה ולבדוק 10, 12, 14, 16, דגירה 18 פעמים בדקה. במידת האפשר, כולל 30 מרווחי השני בין פי העיתוי של מערכת העיכול הוא מאוד חשוב. השלם את פרוטוקול בידוד איון ולנתח תשואה איכות איון ומנקודת כל זמן הדגירה. בסופו של דבר תשואה לא אמור לשנות יותר מדי פעמים בין שיא, אבל את האיכות של איים במרווחים אלה עשויים להשתנות. בניסויים עוקבים, השתמש התנאים לגרום המספר הגדול ביותר של איים כי הם בריאים 48 שעות לאחר בידוד. הגיל של עכברים מופיע כדי להשפיע על זמן דגירה אופטימליים. אז, להשתמש בעכברים בטווח גיל דומה. באופן אידיאלי, להשתמש 8-12 עכברים בשבוע הישן, אולם אפילו 8-10 עכברים בן חודש יכול להניב איים טוב. לצורך כיול, להשתמש בעכברים צעירים. 2. הליך כירורגי הכן את כל ציוד התקשורת לפני והרדמת חסד העכברים התורם איון. החיטוי או להבה לעקר המכשירים לפני השימוש. כל ריאגנטים ומכשירים (נגיעה דגימות) צריך להיות סטרילי. בידוד ואוסף יד של איים יכול להתבצע מחוץ למכסה המנוע זרימה למינרית ללא הוגדל את השכיחות של זיהום. עם זאת, עיקור של כלים לבוא במגע עם לבלב או איי הוא קריטי למניעת זיהום. הכלים הבאים נדרשים: 1 זוג מספריים לנתח את החתך בבטן. 2 זוגות של מלקחיים. 1 מלקחיים עוצר דמום כדי לצבוט את צינור המרה. 0.419 מ"מ קוטר התיל. בקוטר 0.1 מ"מ ניילון רשת. בנד מספר 27 מחטים מד כך זווית 70 מעלות הוא הציג בערך באמצע הדרך לאורך המחט. קצה משופעים של המחט צריך הפנים הפנימי של המרפק. מלאו בקבוק ספריי עם אתנול 70%. הגדרת מיקרוסקופ לנתח עם מקור אור נאותה על ספסל מעבדה או ברדס. טרום צמרמורת צנטריפוגות עד 4 ° C. צנטריפוגה חייב להיות הרוטור דלי הנדנדה, להיות מסוגל 900xG, להיות בקירור, ויש להם לשבור שניתן התנתקה. ביום Sorvall RT6000D עם H1000B Sorvall הרוטור, מהירות 900xG היא 2400RPM. ספינים נעשים איטיים יותר ב 800RPM. מניחים את ריאגנטים הבא על הקרח. RPMI (1 ליטר עם סרום 10%) RPMI (200 מ"ל ללא נסיוב) 50 מ"ל צינורות חרוטי (1 עבור כל הלבלב) 5 מ"ל במזרק. לאזן Histopaque1077 לחדר בטמפהrature. הפשרה aliquot להשתמש יחיד של Liberase מכויל על קרח לדלל ב 22.5ml בסרום חינם RPMI. סרום, BAS ו EDTA לעכב Liberase. אבץ וסידן הם cofactors. חנות על הקרח ושימוש בתוך 1.5 שעות. זה מספיק כ 11 עכברים (2ml/mouse). חמים 37 ° C אמבט מים. האם על יד כמו עכברים רבים ככל שאתה יכול cannulate בשעה 1 (כ 10-18 עכברים). הכן את העכבר על cannulation. ראשית להרדים את העכבר על ידי פריקה צוואר הרחם או מחנק 2 CO. בעוד העכבר שפג תוקפם, למלא את מזרק 5 מ"ל עם מלאי 2ml Liberase עבודה (1.08 יחידות וונש / ml). המקום עכבר בעמדה פרקדן על מגבת נייר בהיקף הניתוח, לרסס את הבטן עם אתנול 70% לפני פתיחת הבטן שלה עם חתך-V מאזור הערווה הן הרגליים הקדמיות. קפל עור מעל החזה כדי לחשוף את חלל הבטן. מקם את העכבר עם הראש והצביע לעבר אותך. אתר את הערך של התריסריון בצינור המרה המשותף מודגשת כמו תמונה 1. ניתן לעשות זאת מבלי להסתכל דרך אובייקטיבית היקף הניתוחים. קלאמפ הפתיחה התריסריון עם hemostat כפי שמודגם Fig.2. העמדה הצמד הוא קריטי עבור חוסם את זרימת Liberase לתוך המעיים. אם מהדק הוא גבוה מדי או נמוך מדי, Liberase לא perfuse את הלבלב. Hemostat מיקום, כך שכאשר דחוס, הוא פועל בדיוק לאורך דייר הלבלב / המעי. לפני cannulating את צינור המרה המשותף, ייתכן שיהיה צורך למקם מחדש את הכבד על ידי לחיצה על אותו נגד הסרעפת, כך אורכו של צינור המרה המשותף חשוף (Fig.3). לאחר אורך בצינור המרה חשוף, השתמש מחט כפוף 27-gague מצורף מזרק Liberase מלא עבור cannulation. ישנן שתי טכניקות cannulating את צינור המרה. בטכניקה הראשונה, או שיטת "יד חופשית", hemostat הידק על התריסריון היא התרחקה מראשו של העכבר לכיוון הזנב כך את צינור המרה המשותף הופך מתוח. יש מפגש ב לסגור את צינור המרה אל הכבד שבו ניקוז מרה מן בכיס המרה ואנזימים מהכבד לבוא יחד לפני הכניסה המעיים. החלק הפנימי של V שהוקמה על ידי מפגש זה הוא נחשף על ידי משיכת צינור המרה חזק הוא מקום אידיאלי ליזום cannulation של צינור (FIG.4). אם בצורה נכונה, המחט יהיה להחליק דרך V, ואת ישירות cannulate את החלק התחתון של צינור. הכנס את מספר מילימטרים מחט לתוך צינור לפני מחלק Liberase. מיקום המחט אופטימלית חשוב למנוע backflow לתוך הכבד כיס המרה. בנוסף, חשוב כי את המחט לא יוכנס עד כה כי היא חוסמת את צינור הטחול. צינור הטחול הוא קשה לראות סניף של צינור המרה המשותף והוא מנקז את הטחול וזנב הלבלב, אזור עשיר איון. אם המחט שקופיות בעבר פתיחת עבור צינור הטחול, יהיו פחות זלוף מלאה של הזנב הטחול ואת מערכת העיכול מופחתת פוטנציאלי של אזור זה. איון תשואה אופטימלית מתרחשת כאשר עומק המחט שלך רחוק מספיק Liberase לא בורח אל שלפוחית ​​השתן כבד / מרה, אבל לא כל כך רחוק, כי אתה כבר עבר את תעלת הטחול. אתה יכול לבדוק cannulation מוצלח על ידי מחלק כמות קטנה של Liberase. אם אתה רואה את Liberase ממלאים את צינור אז לוותר על שאר 2mls. אם האזור סביב צינור מתחיל למלא, להפסיק מחלק, למקם את המחט, ונסה שוב. בטכניקה השנייה, או שיטת "מלקחיים לסייע", hemostat הידק על התריסריון היא התרחקה מראשו של העכבר לכיוון הזנב כך את צינור המרה המשותף הופך מתוח. לאחר מכן, באמצעות כפוף 27-gague מחט מצורף מזרק 5 מ"ל, לנקב את fascia למטה המרה המשותף צינור קרוב אל הכבד. השתמש את המחט כדי לנקות את fascia מן צינור (FIG.5). בעזרת המחט עדיין במקום, קבע את hemostat למטה להרים זוג מלקחיים. השתמש זרוע אחת של מלקחיים פתוח להרים את צינור המרה שבו המחט ביטל את fascia. רכסי ב מלקחיים ליצור מערכת שתוכל להשתמש כדי להנחות את המחט לתוך צינור. בזמן משיכת צינור ו מלקחיים כלפיך, החלק את המחט בצינור באמצעות מלקחיים כמו לבלימת הכדור. מבחן cannulation על ידי מחלק כמות קטנה של Liberase. אם דביק מתחיל למלא (FIG.5 חץ), לוותר על שאר 2mls. אם האזור סביב צינור מתחיל למלא, להפסיק מחלק, למקם את מחט ונסה שוב. ככל 2mls של Liberase ממלא את הלבלב, האזור ליד התריסריון מתחיל להתרחב הראשון, ואחריו האזור על גבי הבטן, ולבסוף את הזנב הטחול (FIG.6). חפש הרחבה אפילו של הלבלב (FIG.6). אם תחום אחד מתחיל להתרחב אינך רואה את הרקמה הלבנה שווה הרחבת מתפשט, סביר להניח כי את צינור המרה המשותף לא היה cannulated, אך המחט נמצא בתוך הקפסולה הלבלב. מילוי קפסולה עם Liberase לא יביא תשואה גבוהה איון כמו את פני השטח נחשף האנזים יהיה נמוך. במקרה זה, להפסיק זלוף למקם את המחט. לאחר הלבלב כבר perfused, ניתן להסיר את העכבר על ידי משיכת אותו ללא נקודות של מגע עם המעיים, הקיבה והטחול. התחל על ידי הסרת hemostat מן התריסריון. ואז, להשתמש במלקחיים כדי להרים את התריסריון ולהפריד את הלבלב מהמעיים עם זוג השני של מלקחיים (FIG.7A-B). הדבר נעשה על ידי החזקת זוג נוסף של מלקחיים יציב בעודו מושך את המעיים החוצה של הבטן. בשלב הבא, למשוך את הלבלב חינם מהחלק העליון של הקיבה ואת הטחול (FIG.7C-D). לבסוף, להרים את הלבלב מתוך הבטן ופצע אותו ללא הקשרים fascia הנותרים (FIG.7E-F). מניחים את הלבלב בצינור 50 מ"ל חרוטי ולהשאיר אותו על קרח תוך כדי עבודה על עכברים אחרים. התחל טיימר 1 שעה. לקבלת תשואה מירבית איון, המקום היחיד 1 הלבלב בצינור אחד. לא מומלץ להשאיר את pancreata perfused על קרח למשך שעה יותר מ 1, כפי Liberase יתחיל לבזות את הרקמה. בסוף השעה, מיד לעבור לשלב 3.0 עבור כל pancreata שהיו perfused. חזור על שלבים 2.3-2.6 עבור העכברים שנותרו או עד טיימר 1hour החל שלב 2.6 פג. 3. איי טיהור מן Pancreata perfused לפני האיונים יכול להיות מטוהרים מהלבלב, רקמת חייב להיות מעוכל על 37 ° C. קבוצת 50 מ"ל צינורות ועליו איים perfused במעמד תחתית פתוחה שמתאימה לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס. ודא שכל כמוסות מובטחות גם וצינורות לצלול בתוך אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים עבור כמות מדויקת של זמן שנקבע מראש עבור אצווה הנוכחי של Liberase (ראה שלב 1.4). בסוף הדגירה, להזיז את הצינורות כדי להוסיף קרח RPMI1640 עם 10% נסיוב כדי 20mls לכל צינור. מדיה המכילה סרום יעצור את העיכול Liberase. לנתק את הרקמה על ידי רועדת צינורות במרץ 40 פעמים ב 10 שניות. שלב זה הוא קריטי להתאוששות אופטימלית איונים. אפילו עם זלוף Liberase אופטימלית זמן עיכול מכויל היטב, איון התשואה תהיה נמוכה אם הרקמה לא נשברה מעלה. טיפול אגרסיבי של דגימות בשלב זה לא מופיע לפגוע איים העכבר יש צורך לשחרר אותם אשכולות תא אקסוקרינית. כדי להפריד בין איים מהלבלב לעכל, להשלים את השלבים הבאים. בריכת מתעכל pancreata כך ישנם כ 2.5 pancreata לכל צינור. בתוך כך, עשרה צינורות יהיה מרוכז עד 4 צינורות עם 50mls של התקשורת כל אחד. צנטריפוגה צינורות במשך 2 דקות ב 800RPM ו 4 ° C. יוצקים את supernatant ו resuspend את כדורי ב 15-25mls התקשורת עם FBS של 10% על ידי vortexing בעדינות (כדי להתאים את עוצמת המערבולת של כ -50% לכל היותר) במשך כמה שניות. יוצקים את slurry resuspended מבעד לרשת 0.419mm ו משפך לתוך צינור חרוטי טרי 50 מ"ל. זה מפריד את הלא מעוכל, רקמת שומן הלימפה. יש לשטוף את הצינור הראשוני עם 10mls נוספת של התקשורת המכיל 10% FBS ויוצקים מבעד לרשת. חזור על תהליך זה עבור הצינורות הנותרים. צנטריפוגה צינורות במשך 2 דקות ב 800RPM ו 4 ° C. יוצקים את supernatant בזהירות להפוך את הצינורות על מגבת נייר. צפה לוודא כי איים לא להחליק וליפול. נגבו את פנים הצינורות עם מגבת נייר כדי להסיר את המדיה שיורית, נזהר לא להפריע תא גלולה. חזור אל צינורות בתנוחה זקופה. Resuspend את כדורי ב 5mls של בטמפרטורת החדר histopaque1077 ידי vortexing בעדינות במשך כמה שניות. ודא כי ההשעיה היא הומוגנית לפני הוספת 5mls נוספים של histopaque סביב החלק הפנימי של הצינור. זה שוטף את האיונים מהקיר של הצינור. Histopaque שכבת עם 10mls של נסיוב חינם RPMI, נזהר לשמור על ממשק חדה בין histopaque והתקשורת. מוסיפים את התקשורת על ידי pipetting לאט בצד של הצינור בקצב של 1ml לכל 10 שניות. התקשורת צריכה להיות בחלק העליון, ו histopaque על התחתונה. סרום משפיע על צפיפות התקשורת לא אמור לשמש במהלך שלב זה. ספין דגימות צנטריפוגה equilibrated עד 20 ° C ב 2400RPM (900xG) במשך 20 דקות עם האצה איטי מאוד ואין בלימה. צעד זה מפריד בין איים מתאי אקסוקרינית. איים יעברו לממשק בין התקשורת החופשית בסרום Histopaque תוך התאים אקסוקרינית wiיהיה צורה כדורית בחלק התחתון של הצינור. אסוף את האיונים מממשק histopaque / מדיה עם טפטפת 10ml הפנויה סרולוגיות. איי ידבק זכוכית, ולכן pipettes זכוכית לא אמור לשמש אלא אם כן הם כבר siliconized. המקום איים לתוך צינור חרוטי טרי 50 מ"ל. כמה צינורות ניתן ונקווה בשלב זה. ממלאים את צינורות עד 50 מ"ל עם RPMI המכילה סרום. צנטריפוגה צינורות במשך 2 דקות ב 800RPM ו 4 ° C. יוצקים את supernatant ו resuspend איים ב 50mls של RPMI המכילה סרום על ידי vortexing בעדינות. צנטריפוגה הצינורות עבור 90 שניות 800RPM ו 4 ° C. יוצקים את supernatant וחזור לשטוף פעם 1 יותר. יוצקים את supernatant ולקחת צינורות על מכסה המנוע בתרבית רקמה. הוסף עט / סטרפטוקוקוס כדי RPMI המכיל 10% FBS לריכוז סופי של 1% על מנת להפוך את התקשורת בתרבות איון. Resuspend איים ב 5mls של זה בתקשורת ובתרבות. היפוך מסננת 0.1mm תא ניילון ומניחים אותו על צינור חרוטי 15 מ"ל. לאט לאט להעביר את slurry איון resuspended דרך המסננת. איים יישמרו על ידי מסננת תוך התאים אקסוקרינית לעבור לתוך הצינור חרוטי 15 מ"ל. צעד זה מגדיל באופן דרמטי את טוהר איים ביחס זיהום תא אקסוקרינית בסוף הפרוטוקול. יש לשטוף את הצינורית 50 מ"ל חרוטי עם 6mls נוספת של התקשורת פיפטה אותה דרך המסננת. המקום 3mls של התקשורת בתרבות כמו ירידה גדולה בצלחת פטרי 10 ס"מ. היפוך מסננת התא בצד ימין למעלה, כך פני השטח שימש כדי ללכוד את האיונים ניתן טבל ירידה התקשורת. לגעת המסנן את התקשורת תעביר את רוב האיונים לתוך התרבות הלא רקמה שטופלו צלחת פטרי. בעזרת צלחת פטרי ללא טיפול היא קריטית כדי למנוע הידבקות פיזור איון ו אל פני השטח של הצלחת. איים צפים חינם נקטפים בקלות רבה יותר עבור הפרדה לקבוצות הניסוי. פיפטה נוספת 5-7mls של התקשורת בתרבות דרך המסננת לתוך צלחת פטרי לשטוף את כל האיונים שיורי מעל מסננת לתוך הקערה. בדוק את התשואה איכות איון תחת מטרה 4x על מיקרוסקופ הפוכה. Swirling את המנה בצורה סגלגלה צרה תאסוף איים במרכז המנה. אם איים נראים טוב, הם יכולים גם להיות נטל מיד לשימוש ניסיוני או מופרדים באופן שווה בין 4-6 צלחות פטרי 10 ס"מ (לפי 10 עכברים). איים culturing מדי צלחת אותו גורם איים להפוך נמקי ו לבזות. על הניסויים, 250-300 איונים לכל צלחת 6cm עם 2-3mls של התקשורת אינו מופיע להדגיש את האיונים. יהיו כמה איים שמיש בצינור חרוטי 15 מ"ל כי אסף את ניילון 0.1mm התא זרימה דרך מסננת. איים אלה ניתן לשחזר לאחר 3-4 סיבובים של שקיעה הכבידה. לאחר כ 4 דקות של שקיעה, לשאוב אבל כל 1ml כ התקשורת מהצינור ולמלא אותו בראש עם התקשורת והתרבות. שווי צינור להפוך לערבב. חוזרים על תהליך זה מספר פעמים רבות אקסוקרינית מסיר את התאים אחד לתא כי הם איטיים משקעים, ומעשיר את מצרפי כבד של תאים אנדוקריני (איים) כי מהר לשקוע. לאחר השאיפה הסופית, resuspend ב 7mls של התקשורת בתרבות צלחת בצלחת פטרי טריים. 4. עבודה עם איי מבודדת תהליך של בידוד מלחיץ למדי על איים; histopaque רעיל, רועד צעדים צנטריפוגה לגרום ללחץ העצום, והסרת מאספקת דם לארח כמו גם בתרבות במבחנה יכול לגרום היפוקסיה. אנו ואחרים הראו כי הבידוד גורם למוות התא בטא 4-5. ההשפעה של המתחים הללו נתפסת על ידי השלת התאים מהפריפריה של איון ו המחשיך וגירוש של הליבה המרכזית של איון (נמק מרכזי). בעוד את נשירת התאים מהפריפריה יכול להיות נסבל, נמק המרכזי של איון פוסל אותו לשימוש בניסויים. בדרך כלל, גדול יותר איון, כך גובר הסיכוי כי נמק המרכזי תהיה בעיה. המאמצים לצמצום הבידוד הודעה של איון תגובת הלחץ תגדיל את התשואה של איים שמיש. לכן, אנו משתמשים בטכניקה של דוגרים שדווח קודם לכן איים על 22-27 ° C תרבות רקמות חממה עבור 48-72 השעות הראשונות לאחר בידוד 6-8. זו הטמפרטורה מופחת dampens את התגובה איים מתח מחליק המעבר שלהם בתרבות חוץ גופית. אם 22-27 ° C תרבות רקמות החממה אינו זמין, ניתן להשיג את טווח הטמפרטורה הרצויה בתרבות תקן רקמות חממה ידי כיבוי לשלוט בחום הצבת 20 £ של כבמקפיא לבנים equilibrated ל -80 ° C. התוצאה היא כ 16-24hours מופחת של הטמפרטורה בחממה. החלפת -80 ° C לבנים במקפיא לפי הצורך. אנחנו לא נצפה יתרון נוסף של של דגירה בטמפרטורה זו נמוכה יותר 72hrs. בנוסף הדגירה הטמפרטורה הנמוכה, אנו ממליצים לשנות את התקשורת 24-48 שעות לאחר בידוד. גורמים המופרשים איים לחוצים מת לצבור בבידוד התקשורת הבאים יכולים לקדם איון מתח נוסף. כדי לשנות את התקשורת, להשלים את השלבים הבאים. העברת התקשורת איים מצלחת פטרי אל צינור חרוטי 15 מ"ל בעזרת פיפטה פלסטיק. לשטוף את הצלחת עם 3mls נוספת של התקשורת בתרבות לאסוף איים שיורית. הוסף 3mls נוספות צינור חרוטי 15ml ולאפשר איים על משקעים הכבידה עבור 5min. לשאוב אבל כל 1ml של התקשורת מהצינור חרוטי 15 מ"ל, ואז resuspend איים ב 4mls התקשורת איון תרבות. מעבירים את האיונים התקשורת כדי בצלחת פטרי טריים. הוסף 3mls נוספים של מדיה תרבות צינור חרוטי 15ml לאסוף את כל האיונים שיורית ולהוסיף הזה לצלחת פטרי. שנה את התקשורת איון כל שלושה עד חמישה ימים לאחר מכן. מתי לקטוף איים על ניסוי, לא מומלץ לערבב בין isolations איים שונים. הבסיס המולקולרי של איים מושפע הרבה דברים, כולל כמות הזמן שהם שוהים תרבות הלחץ הבידוד משתנה הכנה כדי הכנה. כדי להפחית את השתנות, ניסויים איון חייב להתבצע על איים כי בודדו באותו זמן. עם זאת, אם הדבר אינו אפשרי, מומלץ מאוד איגום כל האיונים לתוך קבוצה אחת לפני לקטוף אותם ניסויים. כדי לבחור איים לניסויים, להשלים את השלבים הבאים. אם האיונים הם דוגרים על אחד או יותר של המנה, בריכת כל האיונים לתוך צלחת אחת על ידי ביצוע צעדים 4.3.1 דרך 4.3.5 לעיל. אם מנות מרובות של איים מעורבים, שפופרת 50 מ"ל חרוטי אמור לשמש במקום הצינור 15 מ"ל. זה יכול להפחית את השתנות המושרה על ידי הבדלים דקים בתנאים תרבות בין הצלחות בתקופה שלאחר בידוד ההתאוששות. במהלך משקעים הכובד של איים, להקים מיקרוסקופ הפוך מצויד מטרה 4x או 10x. איסוף micropipette p200 וקופסת p200 טיפים סטרילית. מעבירים את האיונים משקעים לצלחת אחת ולעבור את הצלחת המיקרוסקופ. מערבולת הצלחת לאסוף את האיונים למרכז. הסר את מכסה הצלחת ולהשתמש פיפטה p200 לאסוף איים בריא. איים בריאה יש דיירים חלקה ללא אזורים במרכז כהה (איור 8). נסו לשמור על חלוקה שווה של איון הגדלים ברחבי מנות ניסיוניות כגודל איון יכול לשנות את התגובה לטיפול. מספר איים לכל קבוצת הניסוי יכול להשתנות בהתאם לצרכים של הניסוי. אנו מעריכים כי אחד איון יש כ 1000-2000 תאים תניב 0.3-1μg של חלבון 25ng של רנ"א מוחלט. שכן מבחני חוץ גופית, קבוצת הניסוי טיפוסי יכול להיות בין 100 ל 250 איים מצופה ב 35mm או 6cm מנות עם 1-3ml של התקשורת. להשתלה, כל עכבר הנמען תדרוש בין 150 ל 400 איים בהתאם לעיצוב הניסוי (ראה שלב 5.2.2 ודיון לפרטים נוספים). כדי למזער את וריאציות הציג תהליך יד קטיף, אנו משתמשים פתח של קצה p200-פיפטה כמדריך להעריך גודל איון. רוב האיונים יש קוטר כמחצית קוטר פתח, ואנחנו לספור כל אחד מהם כפי איון אחד רגיל. כל האיונים גדול או קטן יותר מזה, אנחנו להקצות לספור איון שונה בהתאם. אנו אוספים איים בקבוצות של 2-50 ולהעבירם את הכלים ניסיוני המיועד. אם p200-פיפטה מוגדר בהיקף של 180 מיקרוליטר, אפשר לאסוף איים מרובים (בדרך כלל יותר מ -50 איים) לתוך קצה אחד. לפיכך, על אף איים נקטפים אחד בכל פעם, אפשר לאסוף איים רבים בתוך כל קצה p200 על ידי שליטה על מנגנון שחרור pipetman. זה מקל על איסוף של מאות או אפילו יותר מאלף איים של צורך בניסויים. אנו משתמשים גם פעולה זו אצווה חכם כדי לעזור אפילו את חלוקת איים עם איכות גודל דומה. 5. השתלת כליה Subcapsular איילט לגרום סוכרת אצל עכברים מקבל ההשתלה. המקום עכברים מהיר 4-6 שעות. השתלת אופטימלי צריך להיות בין 6 עד 10 שבועות ישנים לשקול 20-25 גרם בזמן הצום. כדי להריץ את העכברים, להסיר את המזון מן feeding מתלה ותמיד המקום עכברים בכלוב טריים. זה מבטיח מהיר נכון על ידי הפרדת עכברים מכל שיורי חתיכות של מזון שאולי נפל בעבר לכלוב שלהם. תוכנית 80% עד 90% של עכברים להיות סוכרתית. שלוש שעות לתוך הצום, להכין את הצפת ציטראט נתרן. לשקול את 0.735g של האנזים ציטראט נתרן כיתה (Na ציטראט, מר 294.10 g / mol) ו לפזר אותו 25mls מים deionized סטרילית. התאם את ה-pH 4.5 כדי להשתמש HCl. מאגר זה צריך להיעשות טרי כל סיבוב של ניסויים. המקום 0.05g Streptozotocin (STZ, M r 265.2 g / mol) לתוך צינור Eppendorph 1.5ml. סכום זה מספיק כדי לגרום לסוכרת ב כ 8 עכברים. הכן מספר מספיק של צינורות 1.5ml למספר של עכברים להיות מוזרק. STZ אור רגיש, כל כך לכסות את כל התחתית ברדיד אלומיניום. אחרי 4 שעות צום, resuspend שפופרת אחת של STZ עם 1ml של טריים Na ציטראט חוצץ. Resuspended פעם, הפתרון STZ-Na ציטראט מאבד את הפעילות בתוך 15 עד 20 דקות, ולכן שלב זה צריך להיעשות רק מיד לפני הזרקת עכברים. להזריק כל intraperitoneally עכבר עם נפח מתאים של תמיסת STZ-Na ציטראט להשיג מנה הסופי של 190mg/kg העכבר. מינון זה עשוי להשתנות על ידי זן וגיל של העכבר, ולכן ייתכן שיהיה צורך לבצע אופטימיזציה של המינון אם את השכיחות של סוכרת נמוכה מדי או אם עכברים רבים מדי מתים 3 עד 5 ימים לאחר ההזרקה. מינונים הנפוצות נע בין 150mg/kg עכבר עכבר 250mg/kg. אספקת מזון ומים פעם כל העכברים כבר הזריק. עכברים מבחן היפרגליקמיה שאינם בצום (> 350mg/kg) 2 עד 4 ימים לאחר ההזרקה. עכברים הממחישים 3 ימים רצופים של היפרגליקמיה הלא צום יכול לשמש מושתלי. הכן איים להשתלה בודד איים כמתואר לעיל באמצעות 4.0 בצעדים 2.0. במידת הצורך, ניתן איים מבודדים ביום ההשתלה או לפני. פיק איים לקבוצות להשתלה ידי הצבתם 1.5ml לתוך צינורות סטרילי Eppendorph. שמור צינורות על הקרח. מספר איים צריך לשחזר normoglycemia עשוי להשתנות בהתחשב בתנאי הניסוי (זן איון התורם, משקל זן של הנמען, וכל הטיפולים הנוספים שניתנו הנמען) ואת מי לקטוף את האיונים. גודלו של העכבר הנמען הוא אחד המשתנה העיקרי שמשפיע על מספר איון מינימלי, כמו עכברים גדולים ידרוש איים יותר. אנו מוצאים באופן עקבי כי 150-250 איים שולי בלבד משחזר normoglycemia בעוד 300 איים או יותר היא מרפא ב 18 ל 20gram C57BL / 6 העכבר הנמען. בניסויים אלו, העכברים התורם איון היו או C57BL / 6 או Balb / ג השתלת איי אל כיס כליה subcapsular להרכיב את החומרים הבאים (כל מכשירי ניתוח חייב להיות מעוקר): טבלה 1. ציוד והשתלות 25μl המילטון מזרק 6 "של צינורות PE 50 גמישה כך לחתוך צד אחד משופעים ג'ל העמסה p200 פיפטה טיפים סטרילי Eppendorph צינורות (1 לכל נמען) Isoflurane ו Isoflurane מאדה Eppendorph צינור מתלה מקפרסון, Vannas מספריים (1) זרוע מלקחיים בנט (2) Hemostats (1) פצע עם קליפ קליפים 27 מחט מד הלהבה משך נימי זכוכית בדיקות צינור * כותנה היטה applicators 50 מ"ל צינור חרוטי של PBS סטרילית Sutures החשמל שירס 70% אתנול בקבוק תרסיס עט כדורי נקודה בבטאדין ברור וילון פלסטיק סטרילית * הערה: כאשר מכינים אלו בדיקות, ניסיון ליצור קשת החללית המחקה את הזווית של הכליה העכבר. בנוסף, יש לוודא כי סופו של החללית היא מספקת flamed מלוטש כך שלא קיימים קצוות חדים. לשקול כל תג עכברים הנמען סוכרתית. הקצאת כל עכבר לקבוצת הניסוי לפני השתלת כך לכל קבוצה מתאימים דומה משקולות הגוף. הגדרת שדה כירורגי בתוך מכסה המנוע הקדמי לפתוח מצויד בשקע גז מאדה Isoflurane. הרדימי עכבר הנמען עם isoflurane ואז לגלח האגף שלה עם מזמרה חשמלית. לגלח את העכבר מחוץ לאזור שבו השתלות יבוצעו. חזור העכבר כדי הרדמה ומקם אותה שוכבת בניצב ישירות מעל הפיר של מוט זכוכית כך האגף מגולח פונה כלפי מעלה. תרסיס האגף עם אתנול 70%. העכבר הוא להיות prepped עם לקרצף כירורגית לסירוגין בבטאדין ואלכוהול חזר שלוש פעמים. הנח את העכבר עם וילון סטרילי ברור המאפשר גישה האגף מגולח. הכן את האיונים להשתלה תוך העכבר מתבצעת בהרדמה. לעשות זאת על ידי השלמת השלבים הבאים. מניחים ג'ל סטרילי טעינת קצה לתוך הפתח של צינור Eppendorph 1.5ml כך יש לכופף בעדינות מה שהופך את צורת U בסוף הצר של קצה. פתיחת קצה צריך להיות פונה ישירות אל מחוץ לצינור Eppendorph. אין להציג שריטה בכל נקודת קצה טעינת ג'ל כמו זו תגרום הגז של איים וירידה במספר איים כי הם מושתלים. בעדינות להסיר קרח צינור של איים כי היה מוכן בשלב 5.2.2. כל האיונים יש התיישבו בחלק התחתון של הצינור. בעזרת פיפטה p200, בעדינות לאסוף את האיונים בהיקף מינימלי מהחלק התחתון של הצינור. העברה אלה איים דרך הפתח גדול של קצה ג'ל טעינת מוכן בשלב 5.3.6.1. איים צריכה להתיישב אורך הצר או הגבלה הצר של קצה טעינת ג'ל. אחרי איים יש משקעים, להסיר כמה שיותר התקשורת מקצה ג'ל טוען שאפשר. ניתן להשיג זאת באמצעות ג'ל טרי טוען קצה מחוברת פיפטה p200 על ידי aspirating התקשורת דרך הפתח גדול של קצה איון נושאות טעינת ג'ל. מעבירים את האיונים משקעים לתוך צינורות PE 50 גמישה (~ 15 ס"מ אורך). ניתן לעשות זאת על ידי הראשון מצרף את הקצה הלא משופעים של הצינור אל הפתח הצר של קצה איון נושאות ג'ל טעינה לפני הצמדת קצה אל טפטפת p200. איים לאחר מכן ניתן נדחק 60% אורך הצינור. העברת הנושא איון צינורות PE 50 ל מזרק 25μl המילטון. ודא הבוכנה במזרק בוטלה לפני העברת הצינור. חבר את קצה שאינם משופעים של צינורות PE 50 ל המחט של המזרק. לוחץ על המתג של המזרק עד האיונים הם 0.5cm כ הרחק פתיחת משופעים. הגדר את המזרק בצד כך איים עשוי להתיישב מסה אחת ליד הפתח משופעים של הצינור ואילו כליות הוא להיות מוכן לקבל את האיונים. בעזרת האצבעות, למקם את הכליה דרך העור של העכבר תחת הרדמה. הפיר של העט נקודת הכדור צריך להיות ישירות מתחת לאזור שבו הכליה ממוקמת וממוקמים בניצב חוט השדרה. לאחר כליות הוא מקומי, השתמש מקפרסון-Vannas מספריים לעשות חתך 2cm דרך הדרמיס ישירות מעל זה בניצב לכיוון עמוד השדרה. חתך זה יהיה לחשוף את קיר הבטן. עם מקפרסון-Vannas מספריים לעשות חתך 1cm דרך דופן הבטן באותו כיוון כמו לחתוך את דרך שכבת הדרמיס. חשוב הפתיחה נוצר על ידי חתך זה להיות קטן יותר את הכליה נחשפים. באמצעות מוט של מוט הזכוכית כמו לבלימת הכדור, הכוח כליה דרך הפתח הצפק על ידי לחיצה על הדואר פני השטח הסמוך. אם הפתיחה היא מעט קטנה יותר הכליה, הכליה יהיה לסחוט דרך הפתח והשאר ביציבות על פני השטח של העכבר ללא מניפולציה או כל מגע נוסף. מיקום זה הוא אופטימלי עבור הצעדים הבאים השתלה. אם הפתח גדול מדי, הכליות תיפול חזרה לתוך חלל הצפק, ולכן קשה כדי להשלים את השלבים הבאים. להרטיב את פני השטח של הכליה חשוף עם קרח קר סטרילי PBS באמצעות צמר גפן טבול היטה המוליך. חזור על שלב זה כל כמה דקות או לפי הצורך כדי למנוע את הקפסולה כליות מהתייבשות. בעזרת מחט מד 27, לעשות חתך 0.2cm באמצעות הקפסולה כליה על פני השטח הקדמי של הכליה נע מצד לרוחב שמאלה לכיוון הצד לרוחב הנכון. שימוש להבה משך בדיקה נימי זכוכית צינור, ליצור כיס בין הקפסולה כליות parenchyma כליות. לעשות זאת על ידי הוספת בדיקה דרך חתך שנעשה בשלב 5.3.12 ו להזיז אותו לכיוון הגב האחורי על פני השטח, לרוחב של הכליה. בדיקה האידיאלי יהיה לכופף אותו התואמת את הקשת הטבעית של המשטח הזה של הכליה. זה יאפשר בדיקה כדי להגיע לסוף האחורי ביותר של הכליה מבלי לקרוע לפתוח פתח קדמי גדול. חשוב לעשות את זה כמו כיס ארוך וצר ככל האפשר. שקיות רחב קצר אינם אידיאליים, מאחר שהם מאפשרים איים לברוח הקפסולה. שקיות ארוך וצר לאפשר איים להיות מופקד לקראת סוף האחורי של הכליה עם הפסד מינימלי מן הכיס קופסית. אחזר את המזרק 25μl המילטון מוכן בשלב 5.3.6 ולהעביר את איים על סף פתיחת משופעים של הצינור הגמיש. הכנס את קצה משופעים של הצינור הגמיש לתוך הכיס subcapsular מוכן בשלב 5.3.13. קצה משופעים צריך להיות פונה כלפי מעלה, כך הקצה הארוך נמצא בקשר עם parenchyma את הכליה. העבר את הצינור עד הסוף האחורי ביותר של הקפסולה. לאט לאט להעביר את האיונים מהצינור PE 50 לנרתיק subcapsular מדכא את הבוכנה של המזרק. כמו איים למלא את הכיס לאט בחזרה את הצינור הגמיש את עושה יותר מקום איים להיות מופקד. ודא שכל איים מועברים הצינור לתוך הכיס. אין למלא את השקית עם אויר או נוזל עודף. לאחר הסרת הצינור 50 PE משקיק, השתמש הלהבה משך בדיקה נימי זכוכית צינור בעדינות כדי לארוז את האיונים אל הקצה הפרוקסימלי של הנרתיק. לעשות זאת על ידי הזזה בדיקה זכוכית על פני השטח החיצוני של הכליה נע הקדמי אל האחורי כיוון. היזהר לא לארוז את האיונים חזק מדי כמו סוף האחורי של הנרתיק subcapsular עלול להיקרע ולשחרר את האיונים. צעד זה מצמצם את ההפסד של איים מן הפתח הקדמי של הנרתיק כאשר הכליה ממוקמת בחזרה בתוך חלל הצפק. בעזרת מלקחיים זרוע כפופה להרים את רירית הצפק סמוך לפתיחת עשה עבור הכליה ולאחר מכן להשתמש כותנה PBS ספוג הטה המוליך בעדינות כדי לדחוף את הכליה בחזרה לתוך חלל הצפק. סגור את העכבר על ידי יישום התפרים אל הקיר הצפק וסרטוני פצע את שכבת הדרמיס. חזור העכבר לכלוב שלו שלבים 5.3.4 דרך 5.3.19 עבור העכברים הנותרים. העכברים צריכים להיות כל הזמן חם עם כרית חימום מתחת לכלוב או מנורת חימום בעיניים מוגן עד העכבר מלא מתאושש מן ההרדמה. בעלי חיים צריכים להיות מסופקים עם acetominophine במים (6 מ"ג / מ"ל). בדוק שאינם בצום הגלוקוז בדם 24hrs רמות מאוחר יותר. כל העכברים צריכים להיות normoglycemic (גלוקוז בדם <200mg/dl) ביום שלאחר הניתוח (POD) 1. 6. נציג תוצאות שני ההליכים העיקריים מתוארים בפרוטוקול זה: (1) בידוד איון ו (2) איון השתלה תחת הקפסולה כליות. בהליך הבידוד איון, התשואות איון נעים בדרך כלל בין 100-150 איונים לכל העכבר בהתאם לגיל ומתח. טוהר איים אלה לגבי ההפרדה שלהם מתאי אקסוקרינית של הלבלב יכול להשתנות משמעותית בין כל הכנה. עם זאת השימוש Histopaque1077 חדר הטמפרטורה בשלב 3.3.7 ומסנן ניילון 0.1mm בשלב 3.3.17 בדרך כלל מאפשרים טוהר יותר מ 99% של איים. טוהר זו מושגת לפני לקטוף כל יד נוספת של איים. נציג תמונות של בידוד איים הבאים שמוצג באיור 8D. כפי שניתן לראות בתמונות אלה, איים בדרך כלל יש גבול היקפי מחוספס בידוד הבאים מיד. עם זאת, עם הזמן בתרבות, איים בריא תרכוש ולשמור על גבול החלקה (איור 8D). בשנת כמה איים, אזור נמקי מרכזי יפתחו,מופיעה כאזור כהה בליבה. מרכז זה נמקי מסולק לעתים קרובות איון כפי שנתפסו על ידי זמן לשגות הדמיה (וידאו משלימה 1). איים הנותרים להופיע חלול במרכז (מידע לא מוצג) וכנראה לא תפקודית. לפיכך, אנו להוציא איים עם מרכז כהה בתהליך איסוף יד. חשוב לציין, מצאנו כי הדגירה בטמפרטורה נמוכה ביצוע ההליך בידוד (שלב 4.2) יכול להפחית באופן דרמטי את מספר איים כי יפתחו נמק מרכזי בתרבות לאורך זמן. בהליך איון השתלה, שני צעדים חיוניים: אינדוקציה הכימי של סוכרת ואספקה ​​של איים לאזור הכליה משנה הקפסולה. לזירוז סוכרת, המטרה היא להשיג hyperglycemic ב 90% יותר מאשר של STZ-הזריקו לעכברים. עכברים אלו ישרדו ללא השתלה למשך מספר שבועות. המינון האופטימלי של STZ כדי להשיג מטרה זו משתנה בהתאם זנים העכבר גיל, צריך להיקבע על ידי ניסויי. מצאנו כי שוני קטן כמו 20mg/kg משקל הגוף יכול לעשות הבדל גדול. לפיכך, טיטרציה עם במרווחים צרים צריך להתבצע. עבור איון השתלה, שיקול מרכזי הוא מודלים, אשר ניתן לנו ארבעה בהקשרים החיסונית: syngeneic, allogeneic, אוטואימוניות syngeneic ו allogeneic אוטואימוניות. במודל syngeneic, את המתח התורם זהה לזן המקבל. לכן, איים לא היה לעורר את התגובה החיסונית אדפטיבית-מן הנמענים. הדבר מאפשר לחוקרים לחקור את סוגיית "הפונקציה העיקרית לא", מונח המתייחס איון תפקוד ואובדן בשל סיבות אחרות מאשר דחייה חיסונית ספציפית על ידי הנמענים. פונקציה אי – יסודי הוא חשב להיות הסיבה העיקרית לכישלון איון בשלב השתלה מוקדמת עבור דרישה של מספר רב של איים (≥ 2 pancreata / המטופל) כדי להשיג euglycemia. לפיכך, הוא נושא קריטי עבור איון השתלה. במודל זה, מסה איון שולית שאינה לחלוטין לשחזר normoglycemia אמור לשמש את העכברים יש לבחון את רמת הסוכר בדם בשלב מוקדם לאחר ההשתלה, בדרך כלל בין 1 ל POD POD 7. מניסיוננו, מסה השולית של איים הוא בדרך כלל בין 150 ל 250 איים בגודל ממוצע מקבל 20 גרם באמצעות זן C57BL / 6 של עכברים. עם המודל syngeneic, אפשר להשתמש איים מהונדסים גנטית או פרמקולוגית כדי לבדוק אם אפנון מסוים משפיע על היעילות הטיפולית של איים בשלב מוקדם לאחר ההשתלה. בכל הדגמים allogeneic ו אוטואימוניות, שתלי איון חשופים להתקפה חיסונית ספציפית על ידי המארח אדפטיבית, חסינות, הכוללת לימפוציטים מסוג T, לימפוציטים-B, ו – תאים חיסוניים אחרים. Adaptive, חסינות היא התגובה החיסונית מתעכבת; כדי assay את התגובה הזאת, יש צורך להשתיל מספר להרוות של איים כי למעשה משחזרת normoglycemia בשלב מוקדם לאחר ההשתלה כדי למזער את ההשפעה של הפונקציה הלא העיקרי. אפשר לעקוב אחר משך הזמן לפני איים נדחות כפי שצוין על ידי אובדן normoglycemia כדי לקבוע את ההשפעות של כל שינוי של איים על דחיית השתל. מניסיוננו, יותר מ 300 איים נדרשים לכל עכבר 20 גרם ו -15 עד 21 יום הם זמן דחייה להשתלה אלוגנאית באמצעות Balb / c (H-2 ד) כפי תורמים C57BL / 6 (H-2 ב) הנמענים. באיור 1. איתור הפתיחה של התריסריון בצינור המרה המשותף. אנזימי עיכול אנדוגני ניקוז מהכבד, הלבלב ואת כיס המרה עוברים בצינור המרה המשותף לפני הכניסה מערכת העיכול בבית התריסריון. כיוון הזרימה דרך צינור זה יכול להיות הפוך אם הלחץ מוחל על המערכת על ידי הוספת נוזל חיצוני. זה יגרום הלבלב להיות מלא ונפוח. איור 2. Clamping הפתיחה של התריסריון בצינור המרה המשותף. על מנת למלא את הלבלב עם Liberase, יש צורך לחסום את הפתיחה של התריסריון בצינור המרה המשותף. אם זה לא יושג כהלכה, Liberase ימלא את המעיים במקום הלבלב. איור 3. מחדש של הכבד נגד הסרעפת מאפשר הדמיה של האזור הפרוקסימלי של צינור המרה המשותף. Cannulation של צינור המרה המשותף ניתן להשיג ביותר בהצלחה, אם הוא ניסה לקראת סוף הפרוקסימלי שלו (בנקודת המפגש בצורת V המתואר 2.3.1). איור 4. Cannulating את צינור המרה המשותף על ידי 'חופשייד 'שיטה. מפגש של צינור המרה המשותף יהפוך לגלוי כאשר hemostat כי הוא הידק מעל התריסריון הוא הוציא לקראת סוף האחורי של העכבר. Cannulation Duct יכולה להיות מושגת על ידי הנחת את המחט 27 מד בנקודת המפגש הזה נהיגה דרכו. איור 5. Cannulating את צינור המרה המשותף על ידי "מלקחיים לסייע" שיטה. כפי שהוזכר בטקסט, לפעמים רקמת fascial המקיפים את צינור מקשה cannulate. (א) במקרים אלה, כדאי לנקות את הפנים שכבה עם מחט מד 27. (ב) צינור לאחר מכן ניתן דמיינו בבהירות נתמך על ידי זוג מלקחיים זרוע מכופפת. (ג) באמצעות מלקחיים כמו לבלימת הכדור, המחט 27 מד יכול להיות מוכנס לתוך צינור לאספקת Liberase. איור 6. גם הרחבה של הלבלב מציין מיקום המחט אופטימלית. בהתחשב באופי השקוף של צינור ורקמות fascial שמסביב, ובמקרים מסוימים היא עשויה להופיע כי הדביק כבר cannulated כאשר למעשה זה לא קרה. במקרה זה ואת המחט חודרת לתוך הקפסולה הלבלב, התריסריון באזור הלבלב תתחיל להתרחב עם מסירת Liberase. עם זאת, הלבלב כולו לא יהיה perfused וזה יגרום איון תשואה נמוכה. כדי להימנע מבעיה זו, לצפות להרחבת אפילו של הלבלב במיוחד על ידי מחפש סימנים של האנזים נכנסים לאזור של הלבלב מצורף החלק הקדמי של הקיבה. איור 7. הסרת הלבלב perfused. כדי להסיר את הלבלב של העכבר, כמה נקודות של מגע עם הקרביים חייב להיות שבור. (AB) הפרד את הלבלב מהמעיים. (ג) הפרד את הלבלב מהבטן. (ד) הפרד את הלבלב מהמעיים. (EF) חותכים כל המגעים עם שאר חלל הצפק. איור 8. ותמונות נציג איים. טוהר איכות יחסית של איונים ניתן לחשב מיקרוסקופית עם השלמת הליך הבידוד. (א) בעוד המטרה היא לטהר איים מן הלבלב, תאים אקסוקרינית ופסולת נוכחים מדי פעם. (ב) הלחץ של בידוד איון יכול לגרום מוות של תאים אשר באה לידי ביטוי באזורים מרכזיים האפל של איים ו השלת התאים מהפריפריה איון. (ג) כאשר איסוף איים לניסוי, להימנע לקטוף את התאים אקסוקרינית מזהם. (ד) איי שינוי המראה עם הזמן בתרבות. כמו איים להתאושש בידוד, שהם רוכשים משטח היקפי חלקה. לעתים איים גדולים באזור מרכזי כהה גלוי. תאים אלה כתם חיובית מוות של תאים. וידאו משלים 1. זמן לשגות מיקרוסקופיה של הפוסט בידוד איים. ב וידאו זה זמן לשגות 16hr איים ניתן לראות בפיתוח מרכזי נמקי כי הם נפלט בסופו של דבר. אנא לחץ כאן וידאו .