Een methode voor Murine Islet Isolatie en subcapsulaire Niertransplantatie

1. Voorbereiding en kalibratie van Liberase reagens Dit protocol maakt gebruik van Liberase TL (Roche, Cat # 05 401 020 001) enzym voor pancreatische spijsvertering. Aankoop van 100-200mg op een tijd en maken een grote partij. Re-schorten gelyofiliseerd poeder in steriel HPLC-kwaliteit water, zodat de concentratie is ongeveer 26 Wünsch eenheden per ml. Dit moet ongeveer 5 mg / ml. Zie de bijsluiter voor meer informatie over de Wünsch eenheden die in de specifieke lot. Plaats flacons op ijs gedurende 30 minuten met niet-Joodse wervelende om de paar minuten. Controleer of poeder volledig is opgelost aan het einde van 30 minuten. Pool alle opgeloste Liberase samen en meng met zachte schudden (NIET vortex of schudden). Aliquot 24,3 Wünsch eenheden om pre-gekoelde Eppendorph buizen, snelle bevriezing van vloeibare stikstof (behandelen als alle enzymen) en bewaar bij -80 ° C. Dit moet ongeveer 0.935ml per Eppendorph buis. Elke hoeveelheid is voor eenmalig gebruik (genoeg voor 11 muizen) en mag niet worden opgeslagen of opnieuw worden ingevroren keer ontdooid. In het algemeen, de voorraad is stabiel gedurende tenminste 6 maanden. Voor elke nieuwe partij, kalibreren de optimale incubatietijd. Gebruik de bevroren voorraad, niet de vers ontbonden voorraad, voor kalibratie, die de werkelijke experimentele condities na te bootsen zoveel mogelijk. Kalibreer het waterbad dat u van plan bent te gebruiken om precies 37 ° C met behulp van een kwik thermometer. Gebruik dezelfde incubator in toekomstige experimenten. Voor gebruik ontdooien een buis van Liberase op ijs en voeg deze toe (0.935ml) om 21.6ml serum vrij RPMI, waardoor de uiteindelijke werking concentratie 1,08 Wünsch eenheden per ml. Serum, BAS en EDTA remmen Liberase. Zink en calcium zijn co-factoren. Op te slaan op het ijs en het gebruik binnen 1,5 uur. Dit is genoeg voor ongeveer 11 muizen (2ml/mouse). Zie stap 2.3 voor pancreas perfusie. Perfuseren zoveel muizen als mogelijk in 1 uur. Gebruik dan een of twee muizen voor elke incubatie tijd en test 10, 12, 14, 16, 18 minuten incubatie tijden. Indien mogelijk, 30 seconden intervallen tussen keer als de timing van de spijsvertering is erg belangrijk. Vul het eilandje isolatie-protocol en analyseren eilandje opbrengst en de kwaliteit van elk incubatietijd punt. Uiteindelijk de opbrengst moet niet te veel wisselen tussen de spitsuren, maar de kwaliteit van de eilandjes op die tijdstippen kan variëren. Voor de daaropvolgende experimenten, gebruik maken van de omstandigheden die resulteren in het grootste aantal eilandjes die gezond zijn 48 uur na isolatie. De leeftijd van de muizen blijkt van invloed op de optimale incubatietijd. Dus, gebruik muizen in een vergelijkbare leeftijd bereik. Idealiter gebruiken 8-12 week oude muizen, maar ook 80-10 maanden oude muizen kan opleveren goede eilandjes. Voor kalibratie doeleinden te gebruiken jongere muizen. 2. Chirurgische Procedure Bereid alle apparatuur en media voor euthanasie het eilandje donor muizen. Autoclaaf of vlam steriliseren instrumenten voor gebruik. Alle reagentia en-instrumenten (het aanraken van de monsters) moet steriel zijn. De isolatie en handmatige oogst van eilandjes kunnen worden uitgevoerd buiten een laminaire stroming kap zonder aanzienlijke verhoging van de incidentie van besmetting. Echter, sterilisatie van gereedschappen die in contact komen met de alvleesklier of eilandjes is van cruciaal belang voor het vermijden van verontreiniging. De volgende gereedschappen zijn nodig: Een paar ontleden schaar voor abdominale incisie. 2 paar pincetten. Een hemostatische tang klem uit de galgang. 0.419 mm diameter gaas. 0,1 mm diameter nylon mesh. Bend verschillende 27 gauge naalden, zodat een 70 graden hoek is ongeveer halverwege geïntroduceerd in de lengte van de naald. De schuine rand van de naald moet naar de binnenkant van de elleboog. Vul een spuitfles met 70% ethanol. Stel een dissectiemicroscoop met een adequate lichtbron op een lab bankje of in een capuchon. Pre-chill centrifuge tot 4 ° C. Centrifuge moeten een schommel emmer rotor, in staat zijn 900xG, worden gekoeld, en hebben een pauze die kan worden ontkoppeld. Op een Sorvall RT6000D met de Sorvall H1000B rotor, een 900xG snelheid is 2400 rpm. Langzamere spins worden gedaan op 800RPM. Plaats de volgende reagentia op het ijs. RPMI (1 liter met 10% serum) RPMI (200ml zonder serum) 50ml conische buizen (1 voor elke pancreas) 5ml spuit. Equilibreren Histopaque1077 naar kamer Tempeperatuur. Dooi een eenmalig gebruik hoeveelheid van gekalibreerde Liberase op ijs en verdund in 22.5ml serumvrij RPMI. Serum, BAS en EDTA remmen Liberase. Zink en calcium zijn co-factoren. Op te slaan op het ijs en het gebruik binnen 1,5 uur. Dit is genoeg voor ongeveer 11 muizen (2ml/mouse). Warm 37 ° C waterbad. Bij de hand hebt zoveel muizen als je kunt canule in 1 uur (ongeveer 10 tot 18 muizen). Bereid je muis voor canulatie. Eerste euthanaseren de muis door cervicale dislocatie of CO 2 stikken. Terwijl de muis is verlopen, vul de 5ml spuit met 2ml Liberase werkvoorraad (1,08 Wünsch eenheden / ml). Plaats de muis in rugligging op een papieren handdoek op de omvang ontleden en spuit de buik met 70% ethanol voor het openen van de buik met een V-incisie van de schaamstreek aan beide voorpoten. Vouw huid over de borst naar de buikholte te onthullen. Plaats de muis met het hoofd naar u toe. Zoek de twaalfvingerige darm ingang van de galbuis zoals in Fig.1. Dit kan worden gedaan zonder te kijken door middel van het ontleden van omvang doelstelling. Klem de duodenale opening met hemostaat zoals aangetoond in figuur 2. Clamp positie is van cruciaal belang voor het blokkeren van de stroom van Liberase in de darmen. Als klem is te hoog of te laag is, wordt Liberase niet perfuseren de alvleesklier. Plaats hemostat, zodat wanneer gecomprimeerd, loopt precies langs de pancreas / darm boarder. Voordat cannulating de galbuis, kan het nodig zijn om de lever te herpositioneren door te drukken tegen het middenrif, zodat de gehele lengte van de galbuis wordt blootgesteld (fig.3). Zodra de lengte van de galwegen blootgesteld, gebruik maken van de gebogen 27-gague naald bevestigd aan de Liberase spuit voor canulatie. Er zijn twee technieken voor cannulating de galwegen. In de eerste techniek, of 'vrije hand' methode, de hemostaat geklemd op de twaalfvingerige darm wordt getrokken uit de buurt van de kop van de muis naar de staart, zodat de galbuis wordt strak. Er is een samenvloeiing in de galgang dicht bij de lever, waar gal aftappen uit de galblaas en enzymen van de lever bij elkaar komen voor het invoeren van de darmen. De binnenkant van de V gevormd door deze samenloop is blootgesteld door te trekken de galwegen strak en is een ideale plek om canulatie van het kanaal (fig. 4) in te leiden. Indien correct geplaatst, zal de naald rechts schuiven door de V, en direct canule het onderste gedeelte van het kanaal. Steek de naald enkele millimeters in het kanaal voor het afgeven van de Liberase. Een optimale plaatsing van de naald is het belangrijk om terugstroming te voorkomen dat in de lever en de galblaas. Daarnaast is het belangrijk dat de naald niet zo ver dat het de milt kanaal belemmert worden ingevoegd. De milt kanaal is een moeilijk te zien tak van de galwegen en het afvoeren van de milt staart van de alvleesklier, een eilandje rijk gebied. Als de naald glijdt voorbij de opening voor de milt kanaal, zal er minder dan complete perfusie van de milt staart en mogelijk verminderde vertering van dit gebied. Optimale eilandje opbrengst treedt op wanneer de naald diepte is ver genoeg dat er geen Liberase ontsnapt aan de lever / galblaas, maar niet zo ver dat u de milt kanaal doorgegeven. Je kunt testen voor een succesvolle canulatie door het afgeven van een kleine hoeveelheid Liberase. Als u de Liberase het vullen van het kanaal dan afzien van de rest van de 2mls. Als het gebied rond het kanaal begint te vullen te stoppen, doseren, de positie van de naald, en probeer het opnieuw. In de tweede techniek, of 'pincet te helpen' methode, de hemostaat geklemd op de twaalfvingerige darm wordt getrokken uit de buurt van de kop van de muis naar de staart, zodat de galbuis wordt strak. Vervolgens, met behulp van de gebogen 27-gague naald aan de 5ml spuit, prik de fascia onder de galbuis dicht bij de lever. Gebruik de naald op de fascia uit de koker (fig.5). Met de naald nog steeds op zijn plaats, stelt u de hemostaat beneden en pak een pincet. Gebruik een arm van de open pincet omhoog om de galwegen, waar de naald is verdwenen van de fascia. De ribbels in de tang een landstreek die u kunt gebruiken om de naald te begeleiden in het kanaal. Trek de buis en de tang naar u toe, schuif de naald in het kanaal met behulp van de tang als een backstop. Test voor canulatie door het afgeven van een kleine hoeveelheid Liberase. Als het kanaal begint te vullen (fig.5 Arrow), afzien van de rest van de 2mls. Als het gebied rond het kanaal begint te vullen te stoppen, doseren, verplaatsen van de naald en probeer het opnieuw. Omdat de 2mls van Liberase vult de alvleesklier, het gebied rond de twaalfvingerige darm begint uit te breiden eerst, gevolgd door de regio op de top van de maag, en tenslotte de milt staart (fig. 6). Kijk voor zelfs uitbreiding van de alvleesklier (Fig.6). Als een gebied begint uit te breiden en je niet ziet de witte weefsel gelijkmatig uitbreiden en uitspreiden, is het waarschijnlijk dat de galbuis niet is gecanuleerde, maar de naald zich in de alvleesklier capsule. Het vullen van de capsule met Liberase zal niet resulteren in een hoog eilandje rendement als de oppervlakte blootgesteld aan het enzym zal laag zijn. Als dit gebeurt, stop perfusie en plaats de naald. Zodra de alvleesklier is doorbloed, kan het worden verwijderd uit de muis door te trekken vrij van de punten van contact met de darmen, maag en milt. Begin met het verwijderen van de hemostaat van de twaalfvingerige darm. Gebruik dan de tang om de twaalfvingerige darm lift en de alvleesklier te scheiden van de darmen met een tweede pincet (FIG.7A-B). Dit wordt gedaan door te oordelen de tweede pincet vast terwijl u de ingewanden uit de buik. Trek vervolgens de alvleesklier vrij van de bovenkant van de maag en de milt (FIG.7C-D). Tot slot, tilt u de alvleesklier uit de buik en snijd hem vrij van de overige fascia aansluitingen (FIG.7E-F). Plaats de alvleesklier in een 50 ml conische buis en laat het op het ijs tijdens het werken aan de andere muizen. Start een 1 uur timer. Voor maximale opbrengst eilandje, alleen plaats een pancreas in elke buis. Het is niet aan te raden om de geperfuseerde pancreata op het ijs verlaten voor meer dan een uur, omdat de Liberase zal beginnen om het weefsel af te breken. Aan het eind van het uur, direct naar een 3.0 stap voor alle pancreata die werden geperfuseerd. Herhaal de stappen 2,3 tot 2,6 voor de overige muizen of totdat de timer een uur begon in stap 2.6 is verstreken. 3. Zuiveren Eilandjes van de geperfuseerde pancreata Voordat de eilandjes kan worden gezuiverd door de pancreas, het weefsel moet worden verteerd bij 37 ° C. Groep van de 50 ml buizen met de geperfuseerde eilandjes in een open onderste rek dat past in de 37 ° C waterbad. Zorg ervoor dat alle doppen goed zijn beveiligd en dompel buizen in de 37 ° C waterbad voor de precieze hoeveelheid tijd die vooraf bepaald voor de huidige batch van Liberase (zie stap 1.4). Aan het eind van de incubatie, verplaats de buizen tot ijs en voeg RPMI1640 met 10% serum tot 20mls per buis. Serum bevattende media stopt de Liberase spijsvertering. Scheiden het weefsel door schudden van de buizen krachtig 40 keer in 10 seconden. Deze stap is essentieel voor optimaal herstel van de eilandjes. Zelfs met een optimale Liberase perfusie en strak gekalibreerd spijsvertering tijd zullen eilandje rendement laag zijn als het weefsel wordt niet opengebroken. De agressieve behandeling van de monsters in deze stap niet verschijnt om de muis eilandjes schade en is noodzakelijk om ze te bevrijden van exocriene cel clusters. Te scheiden van de eilandjes uit de alvleesklier verteerd, Voer de volgende stappen. Pool verteerd pancreata zodat er ongeveer 2,5 pancreata per tube. Daarbij zullen tien buizen worden gecondenseerd tot 4 buizen met 50mls van media elk. Centrifugebuizen gedurende 2 minuten bij 800RPM en 4 ° C. Giet het supernatant en resuspendeer de pellets in 15-25mls media met 10% FBS en door vortexen voorzichtig (pas vortex intensiteit tot ongeveer 50% van maximum) gedurende enkele seconden. Giet de geresuspendeerde slurry via de 0.419mm gaas en trechter in een frisse 50ml conische buis. Dit scheidt de niet-verteerde weefsel, vet en lymfe. Spoel de eerste buis met een extra 10mls van media met 10% FBS en giet door het gaas. Herhaal dit proces voor de overige buizen. Centrifugeer de buizen gedurende 2 minuten bij 800RPM en 4 ° C. Giet het supernatans en zorgvuldig de buizen keren op een papieren handdoek. Kijken om ervoor te zorgen dat de eilandjes niet glijden. Veeg de binnenkant van de buizen met een papieren handdoek om resterende media te verwijderen, zorg dat u de cel pellet te verstoren. Keer terug buizen naar een rechtop. Resuspendeer de pellets in 5mls van de ruimtetemperatuur histopaque1077 door vortexen zachtjes gedurende enkele seconden. Zorg ervoor dat de schorsing homogeen is voor het toevoegen van een extra 5mls van histopaque rond de binnenkant van de buis. Dit wast de eilandjes uit de wand van de buis. Overlay histopaque met 10mls van serum vrij RPMI, let daarbij goed op een scherpe interface tussen de histopaque en de media te houden. Voeg de media door pipetteren langzaam langs de wand van de buis met een snelheid van 1 ml per 10 seconden. De media moet op de top, en histopaque op de bodem. Serum van invloed op de dichtheid van de media en mag niet gebruikt worden tijdens deze stap. Spin monsters in een Centrifuge geëquilibreerd tot 20 ° C bij 2400 rpm (900xG) gedurende 20 minuten met een zeer langzame acceleratie en geen remmen. Deze stap scheidt de eilandjes uit de exocriene cellen. De eilandjes zullen migreren naar de interface tussen het serum vrije media en Histopaque, terwijl de exocriene cellen will vormen een pellet op de bodem van de buis. Verzamel de eilandjes uit de histopaque / media-interface met een disposable pipet 10 ml serologische. Eilandjes zullen vasthouden aan glas, dus glas pipetten mogen niet worden gebruikt, tenzij ze zijn gesiliconiseerde. Plaats eilandjes in een frisse 50ml conische buis. Meerdere buizen kunnen worden samengevoegd op dit punt. Vul de buizen tot 50 ml met een serum met RPMI. Centrifugebuizen gedurende 2 minuten bij 800RPM en 4 ° C. Giet het supernatant en resuspendeer de eilandjes in 50mls van serum met RPMI door vortexen voorzichtig. Centrifugeer de buizen gedurende 90 seconden op 800RPM en 4 ° C. Giet het supernatant en herhaal wassen een meer tijd. Giet het supernatant en neem buizen naar de weefselkweek kap. Voeg pen / strep aan RPMI met 10% FBS tot een uiteindelijke concentratie van 1% naar het eilandje cultuur media te maken. Resuspendeer de eilandjes in 5mls van deze cultuur media. Omgekeerde een 0.1mm nylon cel zeef en plaats het op een 15 ml conische buis. Langzaam gaan de geresuspendeerde eilandje slurry door de zeef. De eilandjes zullen worden bewaard door de zeef, terwijl de exocriene cellen passeren in de 15 ml conische buis. Deze stap verhoogt dramatisch de zuiverheid van eilandjes met betrekking tot de exocriene cellen besmetting aan het eind van het protocol. Spoel de 50 ml conische buis met een extra 6mls van media en pipet het door de zeef. Plaats 3mls van de cultuur media als een grote daling van een 10-cm petrischaal. Omkeren van de cel zeef goede kant naar boven, zodat het oppervlak wordt gebruikt om de eilandjes te vangen kan worden gedoopt in de media te laten vallen. Het aanraken van de filter om de media zullen overdracht de meeste van de eilandjes in een niet-weefselkweek behandeld petrischaal. Het gebruik van een niet-behandelde petrischaal is cruciaal voor eilandje hechting en spreiding aan het oppervlak van de plaat te vermijden. Vrij zwevende eilandjes zijn veel gemakkelijker geplukt voor scheiding in experimentele groepen. Pipetteer een extra 5-7mls van de cultuur media door de zeef in het petrischaaltje eventueel resterende eilandjes afwassen van de zeef in de schaal. Controleer het eilandje opbrengst en kwaliteit onder een 4x doel op een omgekeerde microscoop. Wervelende de schotel in een strakke ovale zal het verzamelen van de eilandjes in het midden van de schotel. Als de eilandjes er goed uitzien, kunnen ze ofwel direct worden opgehaald voor experimenteel gebruik of gescheiden gelijkmatig onder de 4-6 10cm petri platen (per 10 muizen). Het kweken van te veel eilandjes in dezelfde schaal zorgt ervoor dat de eilandjes te worden necrotische en af ​​te breken. Voor experimenten, is 250 tot 300 eilandjes per 6 cm schotel met 2-3mls van media niet aan de eilandjes stress. Er zullen een aantal bruikbare eilandjes in de 15 ml conische buis die de 0,1 mm nylon cel zeef stroom verzameld door middel van. Deze eilandjes kan worden hersteld volgende drie à vier ronden van de zwaartekracht sedimentatie. Na ongeveer vier minuten van sedimentatie, alle aspiratie maar ongeveer 1 ml van de media uit de tube en vul het aan de top met cultuur media. Dop van de buis en omkeren om te mengen. Herhaling van dit proces een paar keer verwijdert veel van de single cell exocriene cellen die langzaam sediment, en verrijkt de zwaardere aggregaten van endocriene cellen (eilandjes) die snel zinken. Na de laatste aspiratie, opnieuw in suspensie in 7mls van cultuur en media plaat in een fris petrischaal. 4. Werken met geïsoleerde eilandjes Het proces van isolatie is vrij zwaar op de eilandjes, histopaque is giftig, schudden en centrifugeren stappen veroorzaken pure stress, en het verwijderen van de host bloedtoevoer als in vitro cultuur kan leiden tot hypoxie. Wij en anderen hebben aangetoond dat isolatie beta-celdood induceert 4-5. Het effect van deze spanningen wordt gezien door de vervelling van cellen van de omtrek van het eiland en de verduistering en de verdrijving van de centrale kern van het eilandje (centrale necrose). Terwijl de vervelling van cellen uit de periferie kan worden getolereerd, de centrale necrose van het eilandje diskwalificeert het voor gebruik in proeven. Typisch, hoe groter het eilandje, hoe groter de kans dat de centrale necrose zal een probleem zijn. Inspanningen die gericht zijn op het verminderen van het eilandje de post isolatie reactie op stress verhoogt het rendement van bruikbare eilandjes. Daarom maken we gebruik van een eerder gemelde techniek van het incuberen van de eilandjes in een 22-27 ° C weefselkweek incubator voor de eerste 48-72 uur na isolatie 6-8. Deze lagere temperatuur dempt de eilandjes stress respons en verzacht hun overgang naar in vitro cultuur. Als een 22-27 ° C weefselkweek incubator niet beschikbaar is, is het mogelijk om de gewenste temperatuur in een standaard weefselkweek incubator te bereiken door het uitschakelen van de warmte-controle en het plaatsen van ongeveer 20 pond vanvriezer bakstenen evenwicht gebracht tot -80 ° C. Dit resulteert in ongeveer 16-24 uren van verminderde temperatuur in de incubator. Vervang de -80 ° C vriezer stenen indien nodig. We hebben niet waargenomen een bijkomend voordeel van de incubatie bij deze lagere temperatuur langer dan 72 uur. In aanvulling op de lage temperatuur incubatie, raden wij het veranderen van de media 24-48 uur na isolatie. Uitgescheiden factoren uit gestresst en dood eilandjes zich ophopen in de media volgende isolatie en kan extra eilandje belasting te bevorderen. Om de media, Voer de volgende stappen. Overdracht van de media en eilandjes van het petrischaaltje een 15 ml conische buis met behulp van een plastic pipet. Was de plaat met een extra 3mls van de cultuur media om de resterende eilandjes te verzamelen. Voeg deze extra 3mls aan de 15 ml conische buis en laat eilandjes om de zwaartekracht sediment voor 5min. Aspireren alle maar 1 ml van media van de 15 ml conische buis, dan resuspendeer de eilandjes in 4mls van eilandje cultuur media. Overdracht van de eilandjes en de media een nieuwe petri plaat. Voeg een extra 3mls van de cultuur media om de 15 ml conische buis om eventuele resten van eilandjes te verzamelen en deze toe te voegen aan de Petri plaat. Verander het eilandje media om de drie tot vijf dagen daarna. Bij het uitkiezen eilandjes voor een experiment, is het niet aan te raden om eilandjes mix van verschillende isolaties. De moleculaire baseline van de eilandjes wordt beïnvloed door vele dingen, inclusief de hoeveelheid tijd die zij hebben in cultuur en het isolement benadrukken dat varieert van prep naar prep. Ter vermindering van variabiliteit, moet eilandje experimenten worden uitgevoerd op eilandjes die geïsoleerd waren op hetzelfde moment. Echter, als dit niet mogelijk is, raden we bundelen alle eilandjes in een enkele groep voorafgaand aan de plukken ze voor experimenten. Te halen eilandjes voor experimenten, Voer de volgende stappen. Als eilandjes zijn incuberen in meer dan een schotel, zwembad allemaal eilandjes in een schotel door het volgen van de stappen 4.3.1 tot 4.3.5 hierboven. Als er meerdere gerechten van eilandjes zijn betrokken, moet een 50 ml conische buis worden gebruikt in plaats van de 15 ml buis. Dit kan de variatie veroorzaakt door subtiele verschillen in cultuur omstandigheden tussen de platen tijdens de post-isolatie herstelperiode. Tijdens de zwaartekracht sediment van de eilandjes, het opzetten van een omgekeerde microscoop uitgerust met een 4x of 10x objectief. Verzamel een P200 micropipet en een doos van steriele P200 tips. Breng de gesedimenteerde eilandjes om een ​​enkele plaat en beweeg de plaat aan de microscoop. Swirl de plaat om de eilandjes te verzamelen in het centrum. Verwijder het deksel op de plaat en het gebruik van de P200 pipet om gezonde eilandjes te plukken. Gezonde eilandjes hebben gladde boarders en geen donkere centrum regio's (figuur 8). Probeer een gelijkmatige verdeling van de eilandjes van Langerhans maten in heel experimentele gerechten te handhaven als eilandje grootte kan de respons op de behandeling te veranderen. Het aantal eilandjes per experimentele groep kan variëren, afhankelijk van de noden van het experiment. We schatten dat een eilandje van ongeveer 1000-2000 cellen heeft en levert 0,3-1μg van eiwitten en 25ng totaal RNA. Voor in vitro-testen, kan een typische experimentele groep tussen de 100 en 250 eilandjes verzilverd worden in 35mm of 6cm schotels met 1-3 ml van de media. Voor transplantatie, zal elke ontvanger muis nodig hebben tussen de 150 en 400 eilandjes, afhankelijk van de opzet van het experiment (zie stap 5.2.2 en discussie voor meer details). Het minimaliseren van de variaties die bij de hand picking-proces, gebruiken we de opening van de P200-pipetpunt als een leidraad voor eilandje grootte schatten. De meeste eilandjes hebben een diameter van ongeveer de helft van de opening diameter, en tellen we elk van hen als een standaard eilandje. Alle eilandjes groter of kleiner is dan die, wijzen we een ander eilandje tellen dienovereenkomstig. Wij verzamelen eilandjes in batches van 20-50 en overbrengen naar de aangewezen experimentele gerechten. Als de P200-pipet is ingesteld op het volume van 180 microliter, kan men verzamelen meerdere eilandjes (doorgaans meer dan 50 eilandjes) in een tip. Dus, hoewel de eilandjes worden een voor een geplukt, kan men verzamelen vele eilandjes binnen elk P200-tip door het beheersen van de Pipetman los mechanisme. Dit vergemakkelijkt het plukken van honderden of zelfs meer dan duizend kleine eilandjes die nodig is voor experimenten. We gebruiken deze batch-gewijs operatie om zelfs helpen bij de verdeling van de eilandjes met een vergelijkbare kwaliteit en grootte. 5. Subcapsulaire Kidney Islet Transplantatie Veroorzaken diabetes bij transplantatie ontvangende muizen. Plaats muizen op een 4 tot 6 uur snel. Optimale transplantatie de afnemers moeten worden tussen de 6 tot 10 weken oud en wegen 20 tot 25 gram op het moment van snel. Om snel de muizen, verwijdert u het voedsel uit de feeding rack en altijd de muizen in een frisse kooi. Dit zorgt voor een ware vasten door het scheiden van muizen uit eventueel resterende stukjes voedsel die eerder kan zijn gevallen in hun kooi. Plan voor 80% tot 90% van de muizen te worden diabetes. Drie uur in de vasten, de voorbereiding van de natriumcitraatbuffer. Weeg 0.735g enzym kwaliteit Natriumcitraat (Na Citraat, de heer 294,10 g / mol) en los het in 25mls van steriel gedemineraliseerd water. Breng de pH op 4,5 met behulp van HCl. Deze buffer moet worden vers gemaakt voor elke ronde van de experimenten. Plaats 0.05g streptozotocine (STZ, M r 265,2 g / mol) in een 1,5 ml Eppendorph buis. Dit bedrag is voldoende om diabetes te induceren in ongeveer 8 muizen. Bereid een voldoende aantal 1,5 ml buizen voor het aantal muizen in te spuiten. STZ is licht gevoelig, dus deksel elke buis met aluminium folie. Na 4 uur van snel, resuspendeer een tube van de STZ met 1 ml vers gemaakte Na Buffer Citraat. Eenmaal geresuspendeerd, de STZ-Na citraatoplossing verliest activiteit binnen 15 tot 20 minuten, dus deze stap mag alleen direct worden gedaan voordat het inspuiten van de muizen. Injecteer elke muis intraperitoneaal met een geschikt volume van de STZ-Na Citraat oplossing tot een uiteindelijke dosis van 190mg/kg muis te bereiken. Deze dosis kan variëren door de stam en leeftijd van de muis, dus het kan nodig zijn om een ​​optimalisering van de dosis uitvoeren als de incidentie van diabetes is te laag of als er te veel muizen sterven in de 3 tot 5 dagen na de injectie. Vaak gebruikte doses variëren van 150mg/kg muis om 250mg/kg muis. Het aanbod van voedsel en water nadat alle muizen zijn ingespoten. Test muizen voor niet-nuchtere hyperglykemie (> 350mg/kg) 2 tot 4 dagen na de injectie. Muizen die drie opeenvolgende dagen van de niet-nuchtere hyperglycemie te tonen kan worden gebruikt als transplantatie ontvangers. Voor te bereiden voor transplantatie eilandjes Isoleer eilandjes zoals hierboven beschreven in de stappen 2.0 tot en met 4.0. Indien nodig, kan eilandjes worden geïsoleerd op de dag van de transplantatie of eerder. Pick eilandjes in groepen voor transplantatie door ze te plaatsen in steriele 1,5 ml Eppendorph buizen. Houden buizen op ijs. Het aantal eilandjes die nodig is om normoglycemia te herstellen kan variëren gegeven aan de voorwaarden van het experiment (eilandje donorstam, het gewicht en de stam van de ontvanger, en de eventuele aanvullende behandelingen gegeven aan de ontvanger) en de persoon die het plukken van de eilandjes. De grootte van de ontvanger muis is een belangrijke variabele die minimaal eilandje aantal invloeden, als grotere muizen zullen vereisen meer eilandjes. We consequent vinden dat 150 tot 250 eilandjes slechts marginaal normoglycemia herstelt, terwijl 300 eilandjes of meer is curatief in een 18 tot 20gram C57BL / 6 ontvanger muis. In deze experimenten, het eilandje donor muizen werden ofwel C57BL / 6 of Balb / c. Transplantatie eilandjes aan subcapsulaire nieren zakje Monteer de volgende materialen (alle chirurgische instrumenten moeten gesteriliseerd worden): Tabel 1. Apparatuur voor Transplantatie 25μl Hamilton Spuit 6 "van PE 50 flexibele buizen snijden, zodat de ene kant is schuine Gel laad-en P200 pipettips Steriele Eppendorph buizen (een per ontvanger) Isofluraan en Isofluraan vaporizer Eppendorph buis rek McPherson-Vannas Schaar (1) Bent arm pincet (2) Arterieklem (1) Wond clip met clips 27 gauge naald Vlam getrokken glazen capillair sondes * Cotton getipt applicators 50 ml conische buis van steriele PBS Hechtingen Elektrische Shears 70% Ethanol Spray fles Balpen Betadine doorzichtige plastic steriel laken * Opmerking: Bij het opstellen van deze probes, poging om een ​​boog te maken in de sonde die de hoek van de muis nieren nabootst. Daarnaast is ervoor te zorgen dat het einde van de sonde voldoende gevlamd zo gepolijst dat er geen scherpe randen bestaan. Wegen en tag alle diabetische ontvangende muizen. Wijs elke muis aan een experimentele groep voorafgaand aan de transplantatie, zodat elke groep dezelfde is lichaamsgewicht op elkaar afgestemd. Het opzetten van een chirurgische veld in een open voorzijde kap uitgerust met het gas uitlaat van de Isofluraan vaporizer. Verdoven van een ontvanger muis met isofluraan en dan scheren de flank met de elektrische schaar. Scheer met de muis buiten het gebied waar de transplantaties worden uitgevoerd. Keer terug muis om anesthesie en plaats deze liggen loodrecht op en direct over de as van een glazen staaf, zodat de geschoren flank naar boven. Spray flank met 70% ethanol. De muis wordt voorbereid met een chirurgische scrub van afwisselend betadine en alcohol driemaal herhaald. Drapeer de muis met duidelijke steriel laken die toegang geeft tot de geschoren flank. Bereid de eilandjes voor transplantatie, terwijl de muis wordt verdoofd. Doe dit door het invullen van de volgende stappen. Plaats een steriele gel geladen tip in de opening van een 1,5 ml Eppendorph buis, zodat er een flauwe bocht, die een U-vorm maakt in het smalle uiteinde van de tip. De opening van de tip moet direct op worden geconfronteerd met uit de Eppendorph buis. Geen invoering van een knik op elk punt in de gel laad-tip omdat dit zal resulteren in afschuiving van de eilandjes en een vermindering van het aantal eilandjes die zijn getransplanteerd. Voorzichtig verwijderen van ijs een buis van eilandjes, dat is opgesteld in stap 5.2.2. Alle van de eilandjes moeten worden geregeld op de bodem van de buis. Met behulp van een P200 pipet voorzichtig het verzamelen van de eilandjes in een minimaal volume van de bodem van de buis. Overdracht van deze eilandjes door de grote opening van de gel laad-tip bereid in stap 5.3.6.1. De eilandjes moeten vestigen in de smalle lengte of smalle beperking van de gel geladen tip. Nadat de eilandjes hebben gesedimenteerd, verwijder zoveel mogelijk van de media uit de gel geladen tip mogelijk te maken. Dit kan worden bereikt met behulp van een frisse gel laad-tip aan een p200 pipet opzuigen door de media door de grote opening van het eilandje-dragende gel laden tip. Breng de gesedimenteerde eilandjes in de PE-50 flexibele slang (~ 15 cm in lengte). Dit kan gedaan worden door eerst het bevestigen van de niet-schuine uiteinde van de buis om de nauwe opening van het eilandje-dragende gel laad-tip voor het aanbrengen van de tip om een ​​P200 pipet. De eilandjes kunnen dan worden geduwd door 60% van de lengte van de slang. Breng het eilandje met PE 50 buizen voor een 25μl Hamilton spuit. Zorg ervoor dat de zuiger is uitgenomen voordat de overdracht van de buis. Sluit de niet-schuine rand van de PE-50 slang aan op de naald van de spuit. Druk de zuiger van de spuit totdat de eilandjes liggen op ongeveer 0,5 cm afstand van de schuine opening. Zet de spuit opzij, zodat de eilandjes kan vestigen in een enkele massa in de buurt van de schuine opening van de buis, terwijl de nieren wordt voorbereid om de eilandjes te ontvangen. Met behulp van uw vingers, lokaliseren de nier door de huid van de muis onder narcose. De as van de balpen moet worden direct onder het gebied waar de nieren zich bevindt en loodrecht op het ruggenmerg. Eens de nier is gelokaliseerd, gebruik dan de McPherson-Vannas schaar om een ​​2 cm incisie te maken door de dermis direct boven het in een richting loodrecht op het ruggenmerg. Deze incisie zal blootstellen de peritoneale muur. Met de McPherson-Vannas schaar maken een 1 cm ingesneden peritoneale muur in dezelfde richting als de dwars door de dermale laag. Het is belangrijk dat de opening gecreëerd door deze incisie kleiner zijn dan de nier wordt blootgesteld. Met behulp van de as van de glazen staaf als een backstop, kracht van de nier door de peritoneale opening door te drukken op the aangrenzende oppervlak. Als de opening is iets kleiner dan de nieren, zal de nier druk door de opening en de rest stabiel op het oppervlak van de muis zonder extra manipulatie of neem contact op. Deze positionering is optimaal voor de volgende transplantatie stappen. Als de opening te groot is, zal de nier terug te vallen in de buikholte, waardoor het moeilijk is om de volgende stappen uit te voeren. Nat het oppervlak van de blootgestelde nier met ijs koude steriele PBS met behulp van een gedrenkte katoenen tip applicator. Herhaal deze stap om de paar minuten of als nodig is om de nieren capsule uitdroging te voorkomen. Met behulp van de 27 gauge naald, maak een 0.2cm ingesneden de nier capsule over het voorste oppervlak van de nier het verplaatsen van de linker zijkant naar de rechter zijkant. Met behulp van de vlam getrokken glazen capillaire buis sonde, een zakje tussen de nieren capsule en nieren parenchym. Doe dit door het inbrengen van de sonde door de incisie gemaakt in stap 5.3.12 en beweeg deze in een posterieure richting langs de dorsale-laterale oppervlak van de nier. Een ideale probe zal een bocht in dat de natuurlijke boog van dit oppervlak van de nier wedstrijden. Hierdoor kan de sonde naar de meest achterste einde van de nier te bereiken zonder scheuren opent een groot voorste opening. Het is belangrijk om dit zakje zo lang en smal mogelijk te maken. Korte wijde zakken zijn niet ideaal als zij toestaan ​​dat eilandjes te ontsnappen uit de capsule. Lange, smalle zakken zodat de eilandjes te storten in de richting van het achterste einde van de nier met een minimaal verlies van de capsulaire zakje. Haal het 25μl Hamilton spuit bereid in stap 5.3.6 en verplaats de eilandjes aan de rand van de schuine opening van de flexibele buis. Plaats de schuine rand van de flexibele slang in de buidel subcapsulaire bereid in stap 5.3.13. De schuine rand moet naar omhoog, zodat de lange kant is in contact met de nieren parenchym. Verplaats de tube naar de meest achterste einde van de capsule. Langzaam overdracht van de eilandjes van de PE-50 buis in de subcapsulaire zakje door het indrukken van de zuiger van de spuit. Omdat de eilandjes te vullen het zakje langzaam terug van de flexibele buis uit het maken van meer ruimte voor de eilandjes te storten. Zorg ervoor dat alle eilandjes worden overgedragen van de buis in het zakje. Niet invullen van de zak met lucht of overtollige vloeistof. Na het verwijderen van de PE-50 tube van het zakje, gebruik maken van de vlam getrokken glazen capillaire buis sonde om voorzichtig de eilandjes pack in het proximale uiteinde van het zakje. Doe dit door te schuiven de glazen sonde langs het buitenoppervlak van de nier bewegen in een anterieure richting posterior. Wees voorzichtig niet om de eilandjes pak te strak als het achterste einde van de subcapsulaire buidel kunnen scheuren en de eilandjes release. Deze stap minimaliseert het verlies van de eilandjes uit de voorste opening van het zakje bij de nier terug is geplaatst in de buikholte. Met behulp van een gebogen arm pincet de hoorn van de peritoneale bekleding naast de opening gemaakt voor de nieren en dan gebruik maken van een PBS gedrenkt katoenen tip applicator voorzichtig terug te duwen de nier in de buikholte. Sluit de muis door het aanbrengen van hechtingen aan de peritoneale muur en wond clips aan de dermale laag. Zet de muis aan zijn kooi en herhaal de stappen 5.3.4 tot 5.3.19 voor de resterende muizen. Muizen moeten warm gehouden worden met een verwarmingselement onder de kooi of een warmtelamp met beschermde de ogen tot de muis volledig herstelt van anesthesie. Dieren moeten worden voorzien van acetominophine in het water (6 mg / ml). Later nog eens niet-nuchtere bloedsuikerspiegel 24 uur. Alle muizen moeten normoglycemisch (bloedglucose <200mg/dL) op na de operatie dag (POD) 1. 6. Representatieve resultaten Twee belangrijke procedures zijn beschreven in dit protocol: (1) eilandje isolatie en (2) eilandjestransplantatie in de nier capsule. In het eilandje isolatie procedure, eilandje levert meestal liggen tussen 100 tot 150 eilandjes per muis afhankelijk van de leeftijd en de stam. De zuiverheid van deze eilandjes met betrekking tot hun scheiding van de exocriene cellen van de alvleesklier kan sterk variëren tussen elke voorbereiding. Maar het gebruik van de ruimtetemperatuur Histopaque1077 in stap 3.3.7 en een 0.1mm nylon filter in stap 3.3.17 typisch zorgen voor meer dan 99% zuiverheid van eilandjes. Deze zuiverheid wordt bereikt voordat alle extra handmatige oogst van eilandjes. Representatief beeld van de eilandjes volgende isolement zijn weergegeven in figuur 8D. Zoals te zien in deze beelden, de eilandjes hebben meestal een ruwe rand grens onmiddellijk na isolatie. Echter, met de tijd in cultuur, zal een gezonde eilandjes verwerven en onderhouden van een gladde rand (Figuur 8D). In een aantal eilandjes, zal een centrale necrotische regio te ontwikkelen,verschijnt als een donker gebied in de kern. Dit necrotische centrum is vaak verdreven van het eiland zoals vastgelegd door time-lapse imaging (Supplemental Video 1). De overige eilandjes verschijnen holte in het midden (gegevens niet getoond) en vermoedelijk niet functioneel. Zo sluiten wij eilandjes met donkere centrum tijdens de hand picking-proces. Belangrijk is, vonden we dat een lage temperatuur incubatie gevolg van het isolement procedure (stap 4.2) drastisch kan het aantal eilandjes dat centrale necrose zal in de cultuur te ontwikkelen na verloop van tijd te verminderen. In het eilandje transplantatie procedure, twee stappen zijn cruciaal: chemische inductie van diabetes en de levering van eilandjes aan de nieren sub-capsule gebied. Voor diabetes inductie, het doel is om hyperglycemische bereiken in meer dan 90% van de STZ-geïnjecteerde muizen. Deze muizen zullen overleven zonder transplantatie voor enkele weken. De optimale dosis van STZ om dit doel te bereiken varieert, afhankelijk van muizenstammen en leeftijd, en moet worden bepaald door experimenteel. Wij vonden dat een verschil zo klein als 20mg/kg lichaamsgewicht kan een groot verschil maken. Daarom moet een titratie met een smalle intervallen worden uitgevoerd. Voor eilandjestransplantatie, een belangrijke overweging is de modellen, die kunnen hebben vier immunologische contexten: syngene, allogeen, syngene auto-immuunziekten, en allogene auto. In de syngene model, de donor stam is hetzelfde als de ontvangende stam. Zo zou de eilandjes geen beroep doen op de adaptieve-immuun reactie van de ontvangers. Hierdoor kunnen de onderzoekers het onderzoeken van de problemen rond "primaire non-functie", een term die verwijst naar disfunctie en verlies als gevolg van andere redenen dan de specifieke immuunrespons afwijzing door de ontvangers eilandje. Primaire non-functie wordt gedacht dat de belangrijkste reden voor mislukking eilandje in de vroege transplantatie stadium en voor de eis van een groot aantal eilandjes (≥ 2 pancreata / patiënt) te euglycemia te bereiken. Het is dus een cruciaal punt voor eilandjestransplantatie. In dit model een marginale eilandje massa die niet volledig te herstellen normoglycemia moet worden gebruikt en de muizen zou moeten worden onderzocht op het bloed glucose in het vroege stadium na de transplantatie, meestal tussen de POD 1 tot en met POD 7. In onze ervaring, een marginale massa van eilandjes is meestal tussen de 150 en 250 van gemiddelde grootte eilandjes per 20 gram ontvanger met behulp van de C57BL / 6 stam van muizen. Met de syngene model, kan men gebruik maken van genetisch gemodificeerde of farmacologisch eilandjes om te testen of een bepaalde modulatie van de therapeutische werkzaamheid van de eilandjes van invloed op het vroege stadium na transplantatie. In de allogene en auto-immuun-modellen, zijn het eiland enten blootgesteld aan een specifieke immuun aanval van de gastheer-adaptieve immuniteit, die T-lymfocyten, B-lymfocyten, en andere immuuncellen zich meebrengt. Adaptieve-immuniteit is een vertraagde immuunrespons, voor het testen van deze reactie, is het noodzakelijk om transplantatie een verzadigende aantal eilandjes die effectief normoglycemia herstelt in het vroege stadium na transplantatie om de impact van de primaire non-functie. Men kan dan toezien op de lengte van tijd voordat de eilandjes worden afgewezen zoals aangegeven door het verlies van normoglycemia om de gevolgen van een eventuele wijziging van de eilandjes op de afstoting van het transplantaat te bepalen. In onze ervaring, groter zijn dan 300 eilandjes die nodig per 20 gram muis en 15 tot 21 dagen zijn de afwijzing tijd voor een allogene transplantatie met behulp van Balb / c (H-2 d), als donoren en C57BL / 6 (H-2 b) ontvangers. Figuur 1. Locatie van de twaalfvingerige darm opening van de ductus choledochus. Endogene spijsverteringsenzymen drainage van de lever, alvleesklier en de galblaas passeren de galbuis, voordat u het darmkanaal van de twaalfvingerige darm. De richting van de stroming door deze leiding kan worden teruggedraaid als de druk wordt toegepast op het systeem door het toevoegen van externe vloeistof. Dit zal resulteren in de alvleesklier steeds vol en opgezwollen. Figuur 2. Inklemmen van de twaalfvingerige darm opening van de ductus choledochus. Om te vullen met de alvleesklier Liberase, is het noodzakelijk om de twaalfvingerige darm opening van de ductus choledochus te blokkeren. Als dit niet goed bereikt, zal Liberase vult de darmen in plaats van de alvleesklier. Figuur 3. Herpositionering van de lever tegen het diafragma maakt visualisatie van het proximale deel van de galwegen. Canulatie van de galwegen kunnen de meeste succes kan worden bereikt, als het wordt geprobeerd de buurt van het proximale uiteinde (bij de V-vormige samenvloeiing zoals beschreven in 2.3.1). Figuur 4. Cannulating de galbuis door de 'vrijehand 'methode. Een samenloop van de galbuis wordt zichtbaar wanneer de hemostaat dat is geklemd in de twaalfvingerige darm wordt getrokken naar de achterkant einde van de muis. Duct canulatie kan worden bereikt door het plaatsen van de 27 gauge naald op deze samenloop en rijden door het. Figuur 5. Cannulating de galbuis door de 'pincet te helpen' methode. Zoals vermeld in de tekst, soms de fasciaal weefsel rondom het kanaal maakt het moeilijk canule aan. (A) In deze gevallen is het nuttig om het gezicht laag duidelijk met de 27 gauge naald. (B) De leiding kan dan worden duidelijk gevisualiseerd en ondersteund door een paar van gebogen arm tang. (C) Gebruik de tang als een backstop, kan de 27 gauge naald worden ingebracht in het kanaal voor de levering van Liberase. Figuur 6. Ook de uitbreiding van de alvleesklier geeft optimale naald plaatsing. Gezien de doorschijnende karakter van het kanaal en de omliggende weefsels fasciale, in sommige gevallen kan blijken dat het kanaal is canule terwijl het in feite is het niet. Als dit gebeurt en de naald dringt in de alvleesklier capsule, zal de twaalfvingerige darm gebied van de alvleesklier beginnen uit te breiden bij levering van de Liberase. Toch zal de hele pancreas niet worden doorbloed en dit zal resulteren in een lage opbrengst eilandje. Om te voorkomen dat dit probleem, kijk uit voor zelfs uitbreiding van de alvleesklier door specifiek op zoek naar tekenen van enzym het invoeren van de regio van de alvleesklier aan het voorste gedeelte van de maag. Figuur 7. Verwijderen geperfuseerde alvleesklier. Aan de alvleesklier te verwijderen van de muis, moet een aantal punten van contact met de ingewanden worden verbroken. (AB) Scheid de alvleesklier van de darmen. (C) Scheid de alvleesklier van de maag. (D) Scheid de alvleesklier van de darmen. (EF) Snijd de resterende contacten met de peritoneale holte. Figuur 8. Vertegenwoordiger beelden van eilandjes. De relatieve zuiverheid en kwaliteit van de eilandjes kan microscopisch worden geschat na afloop van de isolatie procedure. (A) Terwijl het doel is om te zuiveren eilandjes uit de alvleesklier, exocriene cellen en vuil zijn af en toe aanwezig. (B) De stress van het eilandje isolatie kan leiden tot celdood die zich manifesteert als een donkere centrale regio's van de eilandjes en het afwerpen van cellen van het eilandje periferie. (C) Bij het ophalen eilandjes voor een experiment, te vermijden plukken de vervuilende exocriene cellen. (D) eilandjes verandering in het uiterlijk met de tijd in cultuur. Als eilandjes te herstellen van isolement, krijgen ze een glad oppervlak randapparaat. Af en toe in grotere eilandjes een donkere centrale gebied zichtbaar is. Deze cellen vlek positief voor celdood. Aanvullende Video 1. Time lapse microscopie van na-isolatie eilandjes. In deze 16H time lapse video van de eilandjes kan worden gezien het ontwikkelen van necrotische centra die uiteindelijk worden uitgeworpen. Gelieve Klik hier voor de video .