وقد اقترح زرع الجزر المعزولة لتكون المعاملة المحتملة للاصابة بداء السكري من النوع 1. نحن هنا وصف الأسلوب لعزل الجزر من بنكرياسات الماوس وزرع لهم في الفضاء تحت المحفظة في الكلى.
منذ بداية العمل الرائد الذي Ballinger Reckard ومما يدل على أن زرع جزيرات لانجرهانز في القوارض السكري يمكن تطبيع مستويات السكر في الدم ، وقد اقترح أن تكون جزيرة زرع علاج محتمل لمرض السكري نوع 1 ، 1،2. في الآونة الأخيرة ، عززت التقدم في زرع المزيد من جزيرة الإنسان هذا الرأي 1،3. ومع ذلك ، واثنين من القيود الرئيسية منع زرع جزيرة من كونها حقيقة واقعة على نطاق واسع السريرية : (أ) شرط لأعداد كبيرة من الجزر لكل مريض ، الأمر الذي يقلل كثيرا من عدد من المستفيدين المحتملين ، و (ب) الحاجة إلى كبت المناعة الثقيلة ، الأمر الذي يؤثر بشكل كبير السكان للأطفال المرضى بسبب تعرضهم لكبت المناعة على المدى الطويل. الاستراتيجيات التي يمكن التغلب على هذه القيود لديها القدرة على تعزيز المرافق العلاجية لزرع جزيرة.
جزيرة زرع كبسولة تحت الماوس الكلى هو النموذج المقبول على نطاق واسع لتحقيق استراتيجيات مختلفة لتحسين جزيرة الزرع. هذه التجربة يتطلب عزل من الجزر ذات جودة عالية وزرع جزيرات إلى المستلمين السكري. كل من الإجراءات الجراحية التي تتطلب خطوات يمكن أن يكون أظهر بشكل أفضل عن طريق الفيديو من قبل النص. هنا ، ونحن الوثيقة الخطوات التفصيلية لهذه الإجراءات من قبل كل من الفيديو وبروتوكول مكتوب. نحن أيضا مناقشة لفترة وجيزة زرع نماذج مختلفة : ، خيفي مسانج ، مسانج المناعة الذاتية ، وخيفي الذاتية.
في المقاطع المذكورة أعلاه ، وصفت لنا خطوات تفصيلية من أجل عزل وزرع البنكرياس الجزر الماوس. هنا نسلط الضوء بإيجاز الخطوات التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح الإجراءات.
1. جزيرة العزلة
الخطوات الرئيسية هي تحديد أمثل الوقت الهضم الأنزيمي (1.4) ، وتحديد المواقع المشبك مرقئ على مدى الاثنى عشر لفتح القناة الصفراوية المشتركة (2.2.3) ، cannulating القناة الصفراوية المشتركة (2.3) ، والهز قوية في البنكرياس بعد ال 37 خلاصة درجة مئوية (3.2) ، وإزالة التلوث الخلايا الإفرازية (3.3.7 و 3.3.16). هذه الخطوات لها تأثير كبير على المحصول وجودة ونقاء من الجزر. ولعل الخطوة الأكثر تحديا تقنيا هو إقناء ؛ إدخال القنية من القناة الصفراوية المشتركة. في الفئران كثيرة ، يمكن أن تكون القناة الصفراوية المشتركة من الصعب تصور ذلك بسبب اللفافة المحيطة بها. ولذلك ، فمن الشائع أن محاولات يقني ؛ يدخل القنية القناة الصفراوية المشتركة نتيجة تغلغل في نسيج اللفافة فقط. في هذه الحالات ، ويبدأ Liberase لملء الأنسجة المحيطة الضام ، ولا يروي البنكرياس. إذا لوحظ هذا ، ووقف تدفق Liberase وإعادة الإبرة بحيث تخترق تجويف القناة الصفراوية. مع الممارسة ، فمن الممكن التعرف بسرعة على الموقف الأمثل لوضع الإبرة واستكمال إقناء ؛ إدخال القنية دون الإضرار قناة قابلة للتفتيت.
2. جزيرة زرع
الخطوات الحاسمة هي تحريض STZ من مرض السكري (5.1) ، والتنفيذ الفعال من الجزر في الحقيبة تحت المحفظة (5.3.14-5.3.16). STZ التماثلية الجلوكوز هو تحدث بصورة طبيعية وغير انتقائي السامة للخلايا إفراز الإنسولين β خلايا الجزر 9. ومع ذلك ، هذا يحدث السمية الانتقائية في مجموعة تركيز ضيق نسبيا. ويتجلى ذلك من خلال حقيقة أن جرعات عالية من STZ يمكن أن يؤدي إلى الفتك (2-3 أيام) السريع في غياب ارتفاع السكر في الدم. ولذلك ، ينبغي توخي الحذر لتحديد الجرعة المثالية من STZ للسلالة وعمر الفئران المستخدمة قبل الشروع في أي تجارب على نطاق واسع. التسليم المادي من الجزر في الحقيبة تحت المحفظة هو أيضا خطوة رئيسية. لتحقيق نتائج متسقة ، لا بد من تقليل الخسائر في الجزر خلال إيصالها. وهذا يمكن أن يحدث إذا كانت هناك عيوب او الدموع في كبسولة الكلى تغطي الحقيبة أو إذا كان حجم حقن كبير جدا. ويمكن تجنب الأضرار التي لحقت كبسولة من خلال التلاعب طيف ودقيق ، وباستخدام الزجاج السلس التحقيق لإعداد الحقيبة تحت المحفظة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصغير حجم الحقن مع إزالة دقيق لطاف في الخطوة 5.3.6.3. إذا تمت إزالة طاف وصولا الى مستوى الجزر الرسوبية ، يوجد عادة أكثر من مساحة كافية في الحقيبة تحت المحفظة إلى مكان 400-500 الجزر. ومع ذلك ، إذا كان حجم الحقن كبير جدا ، والجزر هي أكثر عرضة للتسرب من الحقيبة أثناء عملية الزرع ، المساس استنساخ التجربة.
ضمن هذا البروتوكول ، فمن الممكن تعديل بعض الخطوات وتحقيق النتائج لا تزال مرضية. وتشمل هذه ما يلي : (أ) استخدام انزيم مختلفة لهضم البنكرياس ، (ب) طريقة مختلفة لايصال لانزيم البنكرياس ، (ج) استخدام التدرج المستمر (FSD) Ficoll – الصوديوم ودياتريزوات بدلا من خطوة واحدة Histopaque1077 الكثافة ، و (د) زرع جزيرة إلى أماكن أخرى من subcapsule الكلى.
ويعتقد أن الاستراتيجيات التي يمكن التغلب على القيود المفروضة على زرع جزيرة ستعزز بشكل كبير قدرته العلاجية. لذا ، فإن استخدام نموذج الفئران على النحو الذي فصله هذا البروتوكول يوفر نهج جذابة لتحديد مثل هذه الاستراتيجيات.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل RO1 DK064938 (لTH).
Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
RPMI 1640 | Reagent | Gibco | 31800-022 | |
Liberase TL | Reagent | Roche | 05401020001 | |
Fetal Bovine Serum | Reagent | Gibco | 10437-028 | |
Histopaque1077 | Reagent | Sigma Aldrich | 10771 | |
Penicillin Streptomycin | Reagent | Gibco | 15140 | |
Sodium Citrate | Reagent | Sigma Aldrich | S4641 | |
Streptozotocin | Reagent | Sigma Aldrich | S-0130 | |
HCl | Reagent | Fisher Scientific | A144-212 | |
Isoflurane | Reagent | Vedco | ISOSOL | |
Glass Capillary Tubes | Equipment | Fisher Scientific | 22362574 | |
Insulin Syringe | Equipment | BD Falcon | 329461 | |
27 Gauge Syringe Needle | Equipment | BD Falcon | 305109 | |
Hamilton Syringe #1702 | Equipment | Fisher Scientific | 14813133 | |
10cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 0875712 | |
6cm Petri Plates | Equipment | Fisher Scientific | 07770212 | |
6-0 Suture | Equipment | Ethicon | 8726H | |
PE 50 Flexible Tubing | Equipment | Fisher Scientific | NC9083963 | |
5ml Disposable Syringe | Equipment | BD Falcon | 309603 | |
50ml Conical Tube | Equipment | BD Falcon | 352098 | |
15ml Conical Tube | Equipment | BD Falcon | 352097 | |
0.1mm Nylon Mesh | Equipment | Fisher Scientific | 22363549 | |
0.419mm Wire Mesh | Equipment | Newark Wire Cloth Company | 0300241 | |
Water Bath Incubator | Equipment | Fisher Scientific | 15-462-5 | |
Dissecting Microscope | Equipment | Zeiss | Stemi SV6 | |
Inverted Microscope | Equipment | Nikon | TMS | |
Tissue Culture Incubator | Equipment | Napco | 6300 | |
Dissecting Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS14393 | |
McPherson-Vannas Scissors | Equipment | Kent Scientific | INS500260 | |
Curved Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS15915 | |
Hemostatic Forceps | Equipment | Kent Scientific | INS 500451 | |
Isoflurane Nebulizer | Equipment | Smiths Medical Surgivet | ISOTech 4 OHMEDA | |
Swing Bucket Centrifuge | Equipment | Dupont – Sorvall | RT6000D | |
Swing Bucket Rotor | Equipment | Dupont – Sorvall | H1000B | |
pH Meter | Equipment | Mettler Toledo/ Fisher Scientific | 09313509 | |
Gel Loading Tips | Equipment | Fisher Scientific | 05408151 | |
p200 Tips | Equipment | USA Scientific | 111-0730 |