脑膜炎奈瑟菌 (NM),革兰氏阴性人类特有的呼吸道病原体,人类α-辅肌动蛋白结合。在这里,我们提出了一个可视化的细菌colocalisation后细菌进入到人脑微血管内皮细胞(HBMECs)的α-辅肌动蛋白与细胞内的协议。
脑膜炎奈瑟菌 (Nm的,脑膜炎双球菌)OPC蛋白表面表达不可或缺的外膜蛋白,它可以作为人类上皮细胞和血管内皮细胞的粘附和有效invasin。我们已经确定了OPC,OPC的过程,需要先绑定到vitronectin,如整合素配体的主要受体,并通过这些细胞表达的受体 1的内皮表面的整合。这个过程导致细菌入侵血管内皮细胞的2。最近,我们观察到3人体细胞的整个细胞裂解液中发现了一个100kDa蛋白OPC互动。最初,我们观察到这种相互作用时宿主细胞蛋白电泳分离和抹杀硝化棉覆盖OPC – Nm的表达。互动是直接的,不涉及中间分子。通过质谱,我们建立了α-辅肌动蛋白的蛋白质的身份。由于没有表面表达的α-辅肌动蛋白上找到任何的八个细胞线研究,并作为OPC与血清导致细菌进入到靶细胞的存在的内皮细胞的相互作用,我们研究的两个相互作用的细胞内蛋白质的可能性。对于这一点,体外培养的人脑微血管内皮细胞(HBMECs)感染与OPC -表示长时间的牛和内在的细菌和α-辅肌动蛋白的位置,通过共聚焦显微镜检查。我们观察到细胞骨架蛋白,这是相当大的后8小时内的细菌内部化牛colocalisation时间依赖性增加。此外,定量成像软件的使用,使我们获得了与α-辅肌动蛋白和其他细胞骨架蛋白的牛colocalisation相对措施。在这里,我们提出了一个可视化和量化后进入人体血管内皮细胞的细菌进入细胞内蛋白质的细菌colocalisation的协议,虽然过程也适用于人类的上皮细胞。
内在约束力的可能性OPC – colocalisation细菌的检查和3和8小时的潜伏期后,感染的细胞的细胞骨架蛋白α-辅肌动蛋白表达脑膜炎奈瑟菌进行了探讨使用HBMEC。共聚焦显微镜,可以证明,与α-辅肌动蛋白的脑膜炎奈瑟菌colocalisation 。值得注意的是,虽然细菌在3小时内化,有小colocalisation与α-辅肌动蛋白,在这个时间点。与细胞骨架蛋白的细菌协会似乎需要一个较长时期细胞内居住为8 h后感染期,大量的细菌α-辅肌动蛋白,显然在密切的联系。 α-辅肌动蛋白是一种多功能蛋白,细菌与细胞骨架元素的相互作用,可以对目标细胞的功能,这是当前研究的课题有重大影响。
如上所述colocalisation量化要求细致的样品制备。应特别注意标本固定,封锁期和抗体稀释。最好的信噪比,每个小学和中学抗体应在初步实验中滴定,以确定最佳浓度。根据我们的经验,安装介质Mowiol产生更好的图像。
The authors have nothing to disclose.
该研究是由威康信托基金和脑膜炎英国。 HBMEC细胞系博士KS金。共焦成像和电子显微镜,英国布里斯托尔大学的欧胜生物成像设施。我们还要感谢他们的帮助和建议黄志光Leard,马克博士杰普森(英国布里斯托尔大学),艾伦先生蒂利(珀金埃尔默)。
Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
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12 well plate | Corning | BC311 | ||
Glass Coverslips | VWR | 631-0152 | ||
BHI AGAR | LAB M | LAB048 | ||
M199 | Sigma | M2154 | ||
RPMI 1640 | Lonza | BE12-167E | ||
MEM Non Essential Aminoacids | Sigma | M7145 | ||
HANK’S balanced salt solution | Sigma | H9269 | ||
FBS | Biowhittaker | DE14-801F | ||
Glutamine | Sigma | G7513 | ||
Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | ||
Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | ||
MEM Vitamin solution | Sigma | M6895 | ||
PBSB | Lonza | BE17-513F | ||
BSA | Sigma | A9418 | ||
Paraformaldehyde | Fisher | P/0840/53 | ||
Triton X-100 | Sigma | X-100 | ||
DAPI | Sigma | D-9564 | ||
Vectashield | Vector | H-1000 | ||
Mowiol 4-88 | Calbiochem | 475904 | ||
Anti‑Nm antiserum | Laboratory raised | Rabbit serum | ||
TRITC anti-rabbit Ig | Sigma | T6778 | ||
Anti α‑actinin mAb [7H6] | Abcam | Ab32816 | IgG | |
Anti actin mAb | Sigma | A4700 | IgG2a | |
Anti vimentin mAb | Sigma | V6630 | IgG1 | |
ALEXA FLUOR 488 anti‑mouse IgG | Invitrogen | A11001 | ||
FITC anti-mouse IgG | Sigma | F-2012 |
1. Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM):
Leica SP5 confocal imaging system: This system, by using a combination of AOTF (acousto-optical tuneable filter) and an AOBS (acousto-optical beam splitter), simplifies excitation with specific wave lengths.
2-Software:
Leica confocal software LCS, Leica Microsystems, Germany.
Volocity 5, Improvision, PerkinElmer, USA.