小鼠胚胎的龙文化，一个系统来评价分枝的分子机制

机关文化是一个非常有用的和通用的技术来研究基因和蛋白表达。这些体外培养的方法，可以用来作为初步或补充体内研究。 1。人胚肺隔离定时孕鼠的CO 2麻醉处死postcoitum每天11.5或12.5（E11.5 – 12.5）根据美国国立卫生研究院和OLAW指引。动物被放置在一腔，和100％的CO 2介绍。后的动物是无意识的CO 2流量增加。临床死亡的动物必须得到保证。 以下步骤需要在无菌层流罩条件下完成。子宫是从怀孕的女性。要删除从动物的子宫，怀孕的女性被放置在他们的后面，喷以70％的乙醇。切口在腹部，皮肤是由皮肤向上拉，同时动物的后腿删除。打开腹腔和子宫是从动物中删除。 血是放置在一个充满冷汉克斯平衡盐溶液（HBSS）50 ml锥形管的子宫冲洗掉，并管轻轻摇晃2分钟。 子宫立体解剖显微镜下，然后放置在培​​养皿和发布使用弹簧剪刀切开子宫壁的胚胎从子宫。收获的胚胎，使用一个穿孔勺子，并在冰上放置在一个新的Petri菜含有的HBSS。 立体解剖显微镜下，胚胎肺解剖冷的HBSS（图1）在培养皿菜之一。 分离出胚胎肺是一个Petri菜含有的HBSS使用无菌移液管放在冰上。 2。人胚肺文化 500微升至1毫升，每口井的D-MEM/F-12 50个单位/毫升的青霉素，链霉素的补充，增加了一个Nunclon聚苯乙烯盘。 一个Nuclepore聚碳酸酯轨道蚀刻膜是放在媒体上。当Nuclepore聚碳酸酯履带式蚀刻膜放在媒体上，确保有光泽的一面是对媒体，和粗糙的一面朝上。 Nuclepore聚碳酸酯轨道蚀刻膜使用无菌移液管上放置一个解剖的胚胎肺。 使用镊子胚胎肺的位置调整。胚胎肺放置在过滤器上应该有一个完整的气管，并放置他们的气管内有一条直线的位置，从而使所有的肺部有相同的内部压力。 Nunclon聚苯乙烯菜是在细胞培养箱（图2）所需的培养时间为转移。 3。材料 1。胚胎全肺隔离定时怀孕（C57BL6野生型或转基因）postcoitum每天11.5 13.5（E11.5 – 13.5）牺牲的小鼠。 汉克斯“平衡盐溶液（HBSS）（1X），液体，无氯化钙，氯化镁，硫酸镁。 （Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州），辅以50个单位/毫升的青霉素，链霉素（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。在室温下储存在4 ° C开盘后的HBSS。分装和储存在-20 ° C的青霉素，链霉素立体解剖显微镜（莱卡，韦茨拉尔，德国）。 解剖工具，包括杜蒙钳，细虹膜剪刀（直），诺伊斯弹簧剪刀和莫里亚®汤匙（穿孔）（精细的科学工具，福斯特城，加利福尼亚州）。 2。胚胎全肺文化贝科的改良Eagle中等：营养组合的F – 12（D-MEM/F-12）（1X），液体，1:1包含L -谷氨酰胺，但没有HEPES缓冲液。 （Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州），辅以50个单位/毫升的青霉素，链霉素（Invitrogen公司，卡尔斯巴德，加利福尼亚州）。保持DMEM/F-12瓶远离光线（如铝箔覆盖）4和存储° C。分装和储存在-20 ° C的青霉素，链霉素 Nuclepore聚碳酸酯轨道蚀刻膜，8.0米，13毫米（的Whatman Nuclepore履带式蚀刻膜（滤纸，弗洛厄姆公园，新泽西州）。 Nunclon聚苯乙烯有盖菜，4口井（罗切斯特，纽约）。 一次性转让的吸液管，无菌（尔科技，匹兹堡，宾夕法尼亚州）。 图1。 E12的胚胎肺的剖析 。 （一）从右侧查看E12.5全胚胎（B）右前肢已经从胚胎中删除（C）钳的左手拿着手在盘中持稳胚胎举行。箭头指示（四）胚胎肺在于心（删除后的清扫计划）和前向脊柱。此图显示肺部后，皮肤和摘取心脏，（五 ）咽清除允许从胚胎中分离完整的肺。（F）的额外咽部组织和食道已被削去。解剖E12.5胚胎肺完整的气管和喉部所示。颅叶（CR），（MED）内侧叶，（CA）尾鳍叶，配件（ACC）叶（LE）的左叶。 图2。FGF9诱导间质细胞和上皮细胞在体外生长的肺扩张的扩张（AC）E12.5肺FGF9的情况下在48小时生长。注意：在分支的增加。增长48小时（DF）的E12.5肺FGF9的存在。请注意，扩张的上皮细胞和间质细胞后24小时的文化（五）早。 48小时后（女），上皮细胞的影响更为明显。比例尺：自动对焦400微米4。 这个实验方法的完整的文本协议，在斯普林格协议。