胚微小注射:ゼブラフィッシュ黄身に化合物を送達する技術
Published: April 30, 2023
Abstract
出典:ソルリアン、E.L.、他.モデルシステムダネオ・レリオにおけるCRISPR/Cas9生成遺伝子ノックアウトの効率的な生産と同定J. ヴィス・エクス .(2018).
このビデオでは、ゼブラフィッシュ黄身嚢に化合物を送達する胚微小注射の技術について説明します。
Protocol
1. ゼブラフィッシュ胚へのCRISPR成分のマイクロインジェクション 必要な雄と雌(通常は2つのメスと1または2の雄)の数を所定の位置に仕切りタンクに入れることによって、注入する前の夜に繁殖タンクを設置します。 溶けたアガロース35mLを10cmのペトリ皿に注ぎ、プラスチックモールドをそっとして溶液にくさび状のトラフを作り、気泡を除去するためにモールドをタップして?…
Representative Results
図1:24hpf注入胚の健康状態の比較。 生きている胚(A)は24hpfに発達し、発達を中止した胚(B)と容易に区別される。(B)に似ているか、(A)に大幅に特徴を変えた胚、脊髄湾曲や頭部および眼の発達の変化など、皿から取り除く必要があります
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
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| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
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| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
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Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).