배아 미세 주입 : 얼룩말 어동에 화합물을 전달하는 기술
Published: April 30, 2023
Abstract
출처: 솔리엔, E. L., 외. 모델 시스템 다리오 리리오에서 CRISPR/Cas9에서 생성된 유전자 녹아웃의 효율적인 생산 및 식별. J. 비스 익스프. (2018).
이 비디오는 Zebrafish 노른자 낭에 화합물을 전달하는 배아 미세 주입의 기술을 설명합니다.
Protocol
1. ZEBRAfish 태아에 CRISPR 성분의 미세 주입 배양전 탱크에 원하는 수와 암컷(전형적으로 암컷 2마리, 수컷 1또는 2명)을 배치하여 주입하기 전날 밤 사육 탱크를 설치하여 배양탱크에 분배기를 설치하였다. 1x E3 미디어(재료표 참조)에서 1.5%의 아가로즈를 장착한 미세 주입판을 10cm 페트리 접시에 35mL의 녹은 아가로즈를 붓고 플라스틱 몰드를 부드럽게 놓아 용액에 쐐기 모?…
Representative Results
그림 1: 24 hpf 주입 배아의 건강비교. 24hpf로 개발된 살아있는 배아(A)는, 중단된 발달(B)이 있는 태아와 쉽게 구별된다. (B)를 닮거나 척추 곡률 또는 변경된 머리 및 눈 발달과 같은 (A)에 크게 변경된 특징이 있는 배아는 접시에서 제거되어야 합니다.
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
|
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
|
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).