מיקרו-לינקציה של העובר: טכניקה להעברת תרכובת לתוך החלמון של דג הזברה
Published: April 30, 2023
Abstract
מקור: סורליאן, א.ל., ואח ‘. ייצור יעיל וזיהוי של CRISPR / Cas9 שנוצר נוקאאוטים גנים במערכת המודל דניו rerio. ג’יי ויס אקספ. (2018).
וידאו זה מתאר טכניקה של microinjection עוברי כדי לספק תרכובות לתוך שק חלמון זברה.
Protocol
1. מיקרו-אינג’ינג של רכיבי CRISPR לעוברים של דגי זברה הקם מיכלי רבייה בלילה שלפני ההזרקה על ידי הצבת מספר הזכרים והנקבות הרצויים (בדרך כלל 2 נקבות ו -1 או 2 זכרים) במיכל רבייה עם מחיצה במקום. הכן צלחת microinjection עם 1.5% agarose במדיה 1x E3 (ראה טבלה של חומרים) עם 0.01% כחול מתילן (קוטל פטריות) ?…
Representative Results
איור 1: השוואה בין בריאותם של 24 כ”ס לעוברים מוזרקים. עובר חי (A) שפותח ל-24 כ”ס, נבדל בקלות מעובר שהתפתח (B). יש להסיר עוברים הדומים (B) או בעלי תכונות שהשתנו באופן דרסטי ל-(A), כגון עקמומיות עמוד השדרה או התפתחות שונה של הראש והעין מהצלחת
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
|
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
|
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).