Microinjection embryonnaire : une technique pour livrer un composé dans le jaune de poisson zèbre
Published: April 30, 2023
Abstract
Source : Sorlien, E. L., et autres. Production et identification efficaces des knockouts génétiques générés par CRISPR/Cas9 dans le système modèle Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).
Cette vidéo décrit une technique de microinjection embryonnaire pour livrer des composés dans le sac de jaune de poisson zèbre.
Protocol
1. Microinjection des composants CRISPR dans les embryons de poisson zèbre Installez des réservoirs de reproduction la nuit précédant l’injection en plaçant le nombre de mâles et de femelles désirés (généralement 2 femelles et 1 ou 2 mâles) dans un réservoir de reproduction avec un séparateur en place. Préparer une plaque de microinjection avec 1,5% d’agarose dans 1x E3 media (voir Table of Materials) avec 0,01% de bleu méthylène (un fongicide) en versant 35 mL de …
Representative Results
Figure 1 : Comparaison de la santé des embryons injectés de 24 hpf. Un embryon vivant (A) développé à 24 hpf, se distingue facilement d’un embryon qui a avorté le développement (B). Les embryons qui ressemblent (B) ou ont des caractéristiques radicalement modifiées à (A), comme la courbure vertébrale ou le développement altéré de la tête et des yeux devraient être retirés du plat
Materials
| RNase-free water | Any brand | Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water. |
|
| E3 embryo media | Made in house | Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449 |
|
| Methylene Blue | Sigma-Aldrich | M9140 | Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos. |
| Petri dish | Thermo Fisher | FB0875711Z | Store embryos, cast injection plate |
| Agarose | Denville | CA3510-8 | Casting injection plate, agarose gels. |
| Microinection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | To create wells to hold embryos during injection |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | Dye for visualization of injection |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904-5ML | To calibrate needle injection volume. |
| Transfer pipettes | Any brand | Moving embryos | |
| Razor blade | Thermo Fisher | 11295-10 | Cutting injection needle, tail clipping adult fish. |
| Incubator | Maintaining embryos at 28.5 C. | ||
| Verticle pipette puller | David Kopf Instruments | 700C | Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long |
| Capillary tubes | Sutter Instruments | BF100-58-10 | Geneate needles for injection. |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 | Load solution into injection needles |
| Microinjector | World Precision Instruments | PV 820 | Injecting embryos. |
| Disecting microscope | Leica | Injecting embryos. | |
| Microwave | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Scale | Any brand | Casting injection plate, agarose gels. | |
| Gloves | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| N2 | Any brand | To expell liquid from the capillary for embryo injection | |
| PCR strip tubes | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 200 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| 10 µL tips | Any brand | For all aspects of the protocol. | |
| Micropipettes | Any brand | For all aspects of the protocol. |
Bu Makaleden Alıntı Yapın
Embryo Microinjection: A Technique to Deliver a Compound into the Zebrafish Yolk. J. Vis. Exp. (Pending Publication), e20196, doi: (2023).