Etichettatura e cellule Imaging nel romboencefalo Zebrafish
Özet
Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. Descriviamo qui una tecnica per l'etichettatura di singole cellule o piccoli gruppi di cellule in embrioni di zebrafish intero con membrana mirati proteina verde fluorescente.
Abstract
Chiave per comprendere i processi morfogenetici che forma l'embrione precoce vertebrati è la capacità di celle di immagine ad alta risoluzione. In embrioni di zebrafish, l'iniezione di risultati del DNA plasmide di espressione mosaico, consentendo la visualizzazione di singole cellule o piccoli gruppi di cellule<sup> 1</sup>. Ci descrivono come iniezione di codifica del DNA plasmidico membrana mirati proteina verde fluorescente (mGFP) sotto il controllo di un promotore ubiquitario può essere utilizzata per le celle di imaging in fase neurulazione. Al centro di questo protocollo è la metodologia di imaging per le cellule etichettate ad alta risoluzione e anche nelle sezioni in tempo reale. Questo protocollo prevede l'iniezione di DNA mGFP in embrioni di zebrafish giovani. Gli embrioni vengono poi elaborati per il sezionamento vibratome, l'etichettatura degli anticorpi e di imaging con un microscopio confocale. In alternativa, embrioni vivi esprimendo mGFP è possibile creare immagini utilizzando time-lapse microscopia confocale. Abbiamo già utilizzato questo metodo semplice per analizzare i comportamenti cellulari che guidano la formazione del tubo neurale nella regione romboencefalo di embrioni di zebrafish<sup> 2</sup>. I preparativi fisso permesso per la visualizzazione senza precedenti di forme e di organizzazione delle cellule del tubo neurale, mentre immagini dal vivo accompagnato questo approccio consente una migliore comprensione delle dinamiche cellulari che avvengono durante neurulazione.
Protocol
Discussion
In conclusione, le tecniche descritte qui di etichettatura consentono di analisi singola cella dei processi morfogenetici nell'embrione zebrafish. L'enfasi principale di questo protocollo è sui metodi di imaging per le cellule etichettate nel tubo neurale utilizzando mGFP sotto il controllo di un promotore ubiquitario. Per ulteriori applicazioni di questa analisi lettori transitoria espressione deve fare riferimento ad un recente articolo da Andersen et al. 3.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione NIH assegnato a R. Brewster (1R01GM085290-01A1).
Materials
Solutions
- Hank’s Stock #1: 8.0 g NaCl , 0.4 g KCl in 100 ml dd H2O
- Hank’s Stock #2: 0.358 g Na2HPO4 Anhydrous, 0.60 g KH2PO4 in 100 ml ddH2O
- Hank’s Stock #4: 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
- Hank’s Stock #5: 1.23 g MgSO4x7H2O in 50 ml dd H2O
- 1 X Phosphate Buffer: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02 M PO4, pH 7.3
- Blocking Solution: 2% normal goat serum, 1% bovine serum albumin (BSA), 1% dimethysulfoxide (DMSO)
Referanslar
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish Practical approach series. , (2002).
- Hong, E., Brewster, R. N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish. Development. 133, 3895-3905 (2006).
- Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J Vis Exp. , (2010).
