In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici
Özet
Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.
Abstract
Svelare la rete di interazione delle molecole<em> In-vivo</em> È la chiave per la comprensione dei meccanismi che regolano la funzione delle cellule e del metabolismo. Una moltitudine di opzioni metodologiche per affrontare le interazioni molecolari nelle cellule sono state sviluppate, ma la maggior parte di questi metodi soffrono di essere un po 'indiretto, e quindi difficilmente quantitativo. Al contrario, alcuni approcci quantitativi di fascia alta sono stati introdotti, che però sono difficili da estendere ad elevato throughput. Per combinare le capacità di throughput elevato con la possibilità di estrarre informazioni quantitative, abbiamo recentemente sviluppato un nuovo concetto per identificare interazioni proteina-proteina (Schwarzenbacher<em> Et al</em>., 2008). Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la progettazione e la costruzione di questo sistema che permette di analizzare le interazioni tra un fluoroforo marcata con proteine ("preda") e una proteina di membrana ("esca")<em> In-vivo</em>. Le cellule sono placcati su superfici micropatterned funzionalizzati con anticorpi contro il dominio esca exoplasmic. Bait-preda interazioni sono stati analizzati attraverso la redistribuzione della preda fluorescenti. Il metodo è caratterizzato da elevata sensibilità fino al livello di singole molecole, la capacità di rilevare le interazioni deboli, e la capacità di throughput elevato, il che rende applicabile come strumento di screening.
Protocol
Discussion
Il video che accompagna illustra un metodo per la rilevazione di interazioni proteina-proteina nel plasma-membrana delle cellule viventi (Schwarzenbacher et al, 2008;. Brameshuber et al, 2009;.. Weghuber et al, in stampa). In linea di principio, qualsiasi TIRF piattaforma basata su microscopia può essere utilizzato come sistema di lettura. Solo quando si vuole un'elevata sensibilità (ad esempio per la rilevazione di singole molecole), microscopi avanzato sarà richiesto. Per ottenere i migliori risultati i seguenti punti critici durante il processo di preparazione richiedono particolare attenzione:
- Conservare Cy5-stock soluzione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo e preparare la BSA-Cy5 soluzione lavoro appena prima della stampa microcontact.
- Fare attenzione a non graffiare la micropattern sul PDMS con la punta della pipetta e incubare il campione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo.
- Mettere il vetrino su un tampone sterile per evitare che si attacchi del vetrino alla capsula di Petri. Una volta che il timbro PDMS ha aderito al vetrino, non muoversi.
- Evitare bolle d'aria nella camera di reazione e incubare il campione in condizioni di buio per evitare lo sbiancamento del fluoroforo.
- Non lasciate che il campione secco per più di 2 minuti per evitare la formazione di cristalli di sale.
- Per il distacco delle cellule non usare tripsina come sarà unirà il dominio extracellulare di proteine di membrana finora espresso. Evitare tripsina sarà utile per le proteine con basso tasso di turnover per formare microdisegni subito dopo l'attaccamento delle cellule sulla superficie.
- Controllare il numero di cellule incubate in un microscopio e fare in modo che le cellule non raggiungono più del 30-50% confluenza. Assicurarsi che le cellule vengono rimosse immediatamente eccessivo a causa del fissaggio rapido delle cellule sulla legate agli anticorpi di superficie.
- Solo con diapositive di alta qualità BSA-Cy5 modelli possono essere utilizzati per ulteriori analisi.
- Espressione stabile della proteina fluorescente preda è preferibile a causa di un maggior numero di cellule che possono essere analizzati per scansione.
- Un'adeguata regolazione TIRF è indispensabile per visualizzare modelli a causa di sfondo citosolico.
Il micro-patterning tecnica offre numerose opportunità per l'analisi delle interazioni proteina-proteina. In primo luogo, insieme con la quantificazione dei locali, risolta spazialmente interazioni proteina-proteina anche la rilevazione delle interazioni deboli o indiretta è possibile senza lo svantaggio di dare un elevato numero di falsi positivi o negativi. In secondo luogo consente al ricercatore di analizzare le interazioni proteina-proteina nel plasma-membrana di cellule vive, che è difficile da raggiungere da approcci biochimici come il 2-ibrido schermo. In terzo luogo l'approccio consente la rilevazione di esca-preda interazioni che sono modulati da cambiamenti ambientali come la temperatura, la presenza di diverse proteine o altre molecole o modificazioni post-traduzionali. Così il test permette di modulatori proiezione di una coppia data interazione nel contesto delle cellule vive. Inoltre, riducendo la densità superficiale del ligando cattura o l'uso di leganti monovalente, l'analisi dello stato di riposo diventa possibile. Infine, se adeguatamente le piattaforme di scansione vengono utilizzati, il numero di cellule analizzate è abbastanza alto per soddisfare domande throughput elevato delle aziende farmaceutiche per lo screening di stupefacenti (Ramm, 2005).
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Quentina Beatty, Università di Linz, in Austria, per il suo gentile aiuto, Katharina Strub, Università di Ginevra, in Svizzera, per la hCD71-GFP costruire, e Daniel Legler, Università di Costanza, in Svizzera, per il GPI-GFP DAF-costruire. Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo austriaco della scienza (FWF; progetto Y250-B03) e il GEN-AU progetto del Ministero federale austriaco per la Scienza e la ricerca.
Referanslar
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