Medir a tensão de membrana induzida com Di-8-ANEPPS
Özet
Campo elétrico externo induz uma tensão na membrana de uma célula, chamado de tensão de membrana induzida (ΔΦ). Usando o corante potenciométrica di-8-ANEPPS, é possível medir a ΔΦ não invasiva. Este vídeo mostra o protocolo para a medição ΔΦ utilizando di-8-ANEPPS.
Abstract
Colocação de uma célula em um campo elétrico externo causa uma redistribuição no interior locais de carga e fora da célula nas proximidades da membrana celular, resultando em uma tensão através da membrana. Esta tensão, denominado tensão de membrana induzida (tensão induzida transmembrana também, ou diferença de potencial transmembrana induzido) e denotado por ΔΦ, existe apenas enquanto o campo externo está presente. Se a tensão de repouso está presente na membrana, a tensão induzida sobrepõe (adiciona) para ele. Usando um dos corantes fluorescentes potenciométrica, como di-8-ANEPPS, é possível observar as variações de ΔΦ na membrana celular e medir o seu valor de forma não invasiva. di-8-ANEPPS torna-se fortemente fluorescente quando vinculado à bicamada lipídica da membrana celular, com a mudança da intensidade de fluorescência proporcional à mudança de ΔΦ. Este vídeo mostra o protocolo para a medição ΔΦ utilizando di-8-ANEPPS e também demonstra a influência da forma da célula sobre a amplitude ea distribuição espacial dos ΔΦ.
Protocol
Discussion
Medições da membrana induzidas (transmembrana) de tensão, ΔΦ, pode ser importante em várias situações experimentais, tais como estudos de canais dependentes da voltagem da membrana, a propagação do potencial de ação, a estimulação de células cardíacas, ou eletroporação da membrana da célula [3, 4, 5, 6 , 7]. Com formas simples célula, ΔΦ pode ser calculado analiticamente. Por exemplo, para uma célula esférica, ΔΦ é dada pela equação a Schwan s, que afirma que a tensão é proporcional à intensidade do campo e do tamanho das células e segue a função cosseno ao longo da membrana [8, 9]. Para mais formas de células complicado, ΔΦ pode se desviar consideravelmente do cosseno e deve ser determinado numericamente, usando um computador [2, 10, 11], ou experimentalmente, utilizando um corante potenciométrica [12, 13, 14, 15].
Um dos corantes potenciométrica amplamente utilizado para esta finalidade é di-8-ANEPPS (di-8-butil-amino-naftil-etileno-piridínio-propil-sulfonato), um corante rápido com espectros de excitação e emissão dependente da tensão de membrana, não-invasivo que permite observações das variações do ΔΦ na membrana celular e medir o seu valor. Neste vídeo, vamos mostrar uma abordagem experimental para a determinação de ΔΦ usando di-8-ANEPPS.
O corante foi desenvolvido pelo Professor Leslie Loew e colegas [13, 14] na Universidade de Connecticut e pertence à classe dos corantes de resposta rápida. di-8-ANEPPS é nonfluorescent em água e torna-se fortemente fluorescente quando se incorpora na bicamada lipídica da membrana celular. Uma mudança no resultado ΔΦ em uma mudança da distribuição de carga intramolecular e alterações correspondentes no perfil espectral e intensidade de fluorescência do corante. A intensidade de fluorescência de di-8-ANEPPS varia proporcionalmente à mudança de ΔΦ; a resposta do corante é linear para tensões variando de -280 mV a +250 mV [4, 16]. Mudanças relativamente pequenas na fluorescência do corante coloração da membrana, desigual, e internalização corante fazer di-8-ANEPPS menos adequado para medições absolutas de tensão de membrana, por exemplo, a sua componente de repouso, embora esses esforços também foram relatados [17]. É, no entanto, adequado para medir as mudanças maiores na tensão de membrana, tais como o início da tensão da membrana induzidas em células não excitáveis expostos a campos elétricos externos [12, 13], ou potenciais de ação em células excitáveis [4, 5]. Embora não seja aplicado aqui, di-8-ANEPPS também permite a determinação do ΔΦ por medições raciométrica de excitação de fluorescência [18] ou de emissão [19], o que aumenta a sensibilidade da resposta e reduz os efeitos acima referidos. Como di-8-ANEPPS manchas da membrana, ela também pode ser usado simplesmente como um marcador de membrana [2].
Um dos inconvenientes do corante é que ele está propenso a fotodegradação, de modo que a exposição prolongada à luz forte devem ser evitados. Calibração do corante é feita com um valinomicina ionóforo (i) de potássio e um conjunto de diferentes concentrações de potássio no meio externo [2,18], ou (ii) patch-clamp clamp no modo de tensão [17].
Finalmente, com as medidas de ΔΦ em células esféricas e células de formas mais complexas, o vídeo demonstra a influência da forma da célula sobre a distribuição espacial da amplitude e ΔΦ. Assim, para células esféricas ΔΦ está perto de uma co-seno, de acordo com a equação Schwan, enquanto para formas mais complicadas de células a distribuição espacial da ΔΦ é mais complexa [20] …
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Agência de Pesquisa esloveno com o projeto Z2-9229 e um programa de P2-0249. Este vídeo representa o material suplementar para o "Eletroporação baseado em Tecnologias e Tratamentos" workshop científico e pós-graduação, organizado a cada dois anos pela Faculdade de Engenharia Elétrica da Universidade de Ljubljana, na Eslovénia.
Materials
| Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| di-8-ANEPPS | Invitrogen | D-3167 | potentiometric fluorescent dye | |
| pluronic | Invitrogen | P3000MP | potassium ionophore | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | ||
| SMEM | Sigma-Aldrich | M8167 or M4767 | Spinner modification of the Minimum Essential Medium | |
| Ham-F12 | Sigma-Aldrich | N4888 | culture medium | |
| fetal calf serum | Sigma-Aldrich | F4135 | ||
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | ||
| crystacillin | Pliva | 625110 | antibiotic | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic | |
| Lab-Tek II | Nalge Nunc | 155379 | chamber | |
| DC voltage supply | Elektro-Automatik | |||
| microprocessor-controlled switcher | Custom made | |||
| electrodes | Custom made | Pt/Ir |
Referanslar
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