Una nueva forma de medir la neurotransmisión ópticamente con análogos fluorescentes de la dopamina.
El sistema nervioso transmite señales entre las neuronas a través de la liberación de neurotransmisores durante la fusión de vesículas sinápticas. Para observar la captación de neurotransmisores y liberación de terminales presinápticas individuales directamente, hemos diseñado fluorescentes neurotransmisores falsos como sustrato para el transportador de monoamina vesicular sináptica. El uso de estas sondas para liberar la imagen de la dopamina en el estriado, que hizo varias observaciones pertinentes a la plasticidad sináptica. Hemos encontrado que la fracción de la liberación de las vesículas sinápticas del neurotransmisor por estímulo depende de la frecuencia del estímulo. A cinéticamente distintas "reserva" de la población de vesículas sinápticas no se observó en estas condiciones experimentales. Una heterogeneidad depende de la frecuencia de las terminales presinápticas se reveló que se depende en parte de los receptores D2 de la dopamina, lo que indica un mecanismo para dependientes de la frecuencia de codificación de la selección pre-sináptica.
Hui Zhang y Gubernator Niko G. contribuyeron igualmente a este trabajo.
En este vídeo, se demuestra un método para visualizar la neurotransmisión ópticamente con análogos fluorescentes de la dopamina. FFN511 es la primera generación de FFNs que hemos desarrollado. A pesar de que fue diseñado por objetivo el transportador vesicular de monoaminas neuronales (VMAT2) que lleva la monoamino neurotransmisores desde el citoplasma en vesículas sinápticas y, específicamente, las etiquetas de terminales de dopamina en el estriado y catecolaminas presunta y / o terminales de la serotonina en la corteza (como se muestra en la ciencia papel), un período de carga adecuada es fundamental para la especificidad desde FFN511 es relativamente hidrofóbica. Se encontró que la incubación de más de 40 minutos se traducirá en manchas extensas inespecíficos en rebanadas estriatales. La especificidad puede ser directamente determinado por decoloración utilizando una alta concentración de KCl, que hace que la liberación de FFN dentro de las vesículas sinápticas funcionales. La exposición de la división para FFN511 de menos de 15 minutos se traducirá en una señal débil fluorescencia debido a la carga insuficiente de la tintura en las terminales. En este protocolo, el uso de 100μM ADVASEP-7 para quitar el tinte obligado a tejido extracelular. Este paso no es necesario, pero si se omite, el tiempo de lavado en ACSF debe ser prolongado. En resumen, dependiendo de la preparación que se elija, tendrá que modificar el período de concentración y de carga para determinar el etiquetado óptima.
The authors have nothing to disclose.
D. El Sames gracias Harold G. & Y. Mathers Leila Charitable Foundation y la Universidad de Columbia iniciativas en ciencia e ingeniería.
D. Sames y Sulzer D. agradecer a la Fundación McKnight de las innovaciones tecnológicas en McKnight Premio de Neurociencia
D. Sulzer gracias NIDA, NIMH, y el Picower y Fundaciones Enfermedad de Parkinson.
H. Zhang NARSAD gracias.
HR Edwards gracias al Michael J. Fox Foundation, la Fundación Nacional de Parkinson, el NIDA y el NIMH.
Damos las gracias a Robert Burke por 6-OHDA inyecciones y asesoramiento, Sonders Marcar útil para el debate, Merek Siu para la programación de análisis de imágenes, y Schmoranzer Jan de apoyo técnico con la configuración de la microscopía TIRF.
Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
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FFN511 (8-(2-Amino-ethyl)-2,3,5,6-tetrahydro-1H,4H-11-oxa-3a-aza-benzo[de]anthracen-10-one) | Dalibor Sames’s laboratory at Columbia University | |||
ADVASEP-7 | CyDex, Overland Park, KS | AR-OA7-005 | ||
RC-27L Recording chamber | Warner Instrument | 64-0375 | ||
PELCO PrepEze 6-Well Holder | Ted Pella, Inc. | 36157-1 | For slice incubation | |
Master-8 pulse stimulator and Iso- Flex stimulus isolator | AMPI, Jerusalem, Israel |