Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

Der Gyrus dentatus belegt ca. 25% bis 30% des Volumens des Hippokampus ^2,3. Es hat eine einzigartige Zellzusammensetzung und spielt eine entscheidende Rolle in verschiedenen Funktionen des Gehirns. Daher sind Techniken, um die Gyrus dentatus zu isolieren für die Analyse der Ereignisse, die speziell treten in dieser Region.

Hier haben wir gezeigt, ein Verfahren zur effizienten sezieren Gyrus dentatus aus adulten Maus Hippocampus und bestätigt die Genauigkeit der Technik. Zunächst zeigte histologische Untersuchung, dass der Gyrus dentatus ohne Verunreinigung durch andere Regionen (Abbildung 1) wurde abgetrennt, was darauf hinweist, dass eine reine Gyrus dentatus Probe vorbereitet werden können.

Zweitens bestätigten wir, dass die präparierten Gewebe Gyrus dentatus ist durch die Durchführung real-time PCR des Gyrus dentatus-spezifische Gene, TDO2 und DSP-und Ammonshorn bereichert Gene, Mrg1b und Tyro3 ⁴ (Abbildung 2). Die mRNA Expression von TDO2 (p = 0,000023; n ist = 4 bzw. 4) und DSP (p = 0,0000030; n ist = 4 bzw. 4) im Gyrus dentatus Proben wurden bei offensichtlich höhere erkannt, während Mrg1b (p = 0.000080; n ist = 4 bzw. 4) und Tyro3 (p = 0,00017; n ist = 4 bzw. 4) wurden niedrigere, als die im Ammonshorn Proben. Beta-Aktin-Expression nicht in diesen Proben unterscheiden (p = 0,11; n ist = 4 und 4, jeweils). So können wir überprüfen, ob der Gyrus dentatus genau wurde von der Durchführung solcher einfachen Echtzeit-PCR-Experimente seziert.

Drittens, um den Nutzen dieser Methode Dissektion beurteilen, haben wir die mRNA Expression von ganzen Hippocampus mit dem Gyrus dentatus. Whole Hippocampus und Gyrus dentatus von Wildtyp-(n ist = 9 bzw. 4) und alpha-CaMKII + / erhalten – Mäuse (n ist = 18 bzw. 4) wurden für die Microarray-Analyse aufbereitet und für alle Gene hat, die fach- Veränderung wurde durch Division der Mutante Wert durch die wild-type-Wert berechnet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Veränderungen in mRNA-Expression, insbesondere des Gyrus dentatus-spezifische Moleküle wie DSP und TDO2, mit wurden bis zu einem 5-fache Steigerung der Empfindlichkeit in Gyrus dentatus Proben im Vergleich zum gesamten Hippocampus-Proben (Tabelle 1) festgestellt. Wir haben bereits gezeigt, dass alpha-CaMKII + / – Mäuse zeigen Verhaltensweisen der menschlichen psychiatrischen Störungen wie Arbeitsspeicher Defizite und eine übertriebene infradian Rhythmus ^1,5 verwandt. Darüber hinaus sind morphologische und elektrophysiologische Eigenschaften des Gyrus dentatus Neuronen in mutierten Mäusen ähneln denen von unreifen Gyrus dentatus Nervenzellen im normalen Nagern, was darauf hinweist, dass die Neuronen in diesen mutierten Mäusen bis zur Endfälligkeit zu ^{1 zu} entwickeln scheitern. Die unreifen Gyrus dentatus und down-regulierten Expression von DSP und TDO2 mRNA in alpha-CaMKII + / – Mäuse sind im Einklang mit dem Befund, dass DSP und TDO2 als Marker für reife Körnerzellen kann im Gyrus dentatus (Ohira et al verwendet werden, nicht veröffentlicht. Daten).

Zusammengenommen können diese bequeme und genaue Dissektionstechnik zuverlässig für Studien über den Gyrus dentatus konzentriert eingesetzt werden. Gyrus dentatus Gewebe unter Verwendung dieser Methode ist anwendbar auf andere Arten von Analysen sowie, einschließlich Proteomics und Zellbiologie Analysen.

Abbildung 1. Verification der isolierten Gyrus dentatus durch die histologische Untersuchung. A Frontalschnitt des Gehirns nach Trennung Gyrus dentatus wurde für Nissl-Färbung (links) verarbeitet, und eine schematische Darstellung von Gehirn der Maus atlas6 angepasst repräsentiert die etwa auf dem Niveau des Abschnitts in der linken Seite (rechts) gezeigt. Die Pfeile zeigen die Richtung der Nadelspitze Insertion. Scale-bar, 1 mm.

Abbildung 2. Nachweis der isolierten Gyrus dentatus durch real-time PCR. Der Gyrus dentatus und der Ammon s Horn von vier Wildtyp-Mäusen gewonnen wurden real-time PCR von beta-Aktin, TDO2, DSP, Mrg1b und Tyro3 verarbeitet. Die Ergebnisse werden präsentiert als Mittelwert ± SEM. Für die statistische Analyse wurde Student s t-Test eingesetzt, und p-Werte eingehalten werden: beta-Aktin, p = 0,11; TDO2, p = 0,000023 (** 1); Dsp, p = 0,0000030 (** 2); Mrg1b, p = 0.000080 (** 3); und Tyro3, ​​p = 0,00017 (** 4).

Tabelle 1. . Microarray-Analyse der gesamten Hippocampus und Gyrus dentatus Gene differentiell in Gyrus dentatus und ganze Hippocampus von alpha-CaMKII ausgedrückt + / – Mäuse wurden durch die Berechnung der fold-change aus, dass in Wildtyp-Mäusen nachgewiesen bestimmt. Mäuse – Die Daten wurden auf statistische Signifikanz mit dem Student s t-Test zwischen Wildtyp-und alpha-CaMKII + / analysiert. Unter den Genen, deren Expression zeigte p <0,05 inGyrus dentatus von alpha-CaMKII + / – Mäusen im Vergleich zu der Wildtyp-Mäusen sind die Top-50 Gene aufgelistet. Beachten Sie, dass die Zahl von Proben für Gyrus dentatus viel weniger als jene für die ganze Hippocampus sind. AffyID, Affymetrix-Sonde Kennung; CKII, alpha-CaMKII + / – Mäuse, WT, Wildtyp-Mäusen.