Meme Tümörleri IVIS Spektrum kullanarak in vivo Bioluminescent Görüntüleme

Lusiferaz ifade kanser hücre hatları çok çeşitli fare modelleri, ön-klinik araştırma için kullanılabilir. Bu hücreler kolayca seçim işaretleyicilerini gerek standart medya büyüyecek bir patojen içermeyen dondurulmuş kültür olarak verilmektedir. Deneme için, in vivo gen ekspresyonu veya tumorgenesis optik bir göstergesi olarak hizmet veren lusiferaz gen ifade luc2 4T1 fare meme tümör hücre hattı, kullanacağız. Non-invaziv primer tümörün büyümesini izlemek için luciferase ifade kullanabilirsiniz, ancak onlar da metastatik lezyonlar bulmak ve izlemek için de kullanılabilir. Lusiferaz aktivitesi enjeksiyondan önce ve bunu yapmak için kontrol edilmelidir,% 90 konfluent balon trypsinization hasat ve sonra sayılır. 50.000 hücreler daha sonra bir mikrotiter plate ve seri dilüsyonları tek bir kuyu halinde uygulanmaktadır yapılmaktadır. Luciferase ml'de 150ug kuyulara eklenir ve 2 dakika inkübe. Mikroplak IVIS veya ifade düzeylerini belirlemek için bir ışıldayan plaka okuyucu görüntülü olabilir. Bu hücre hattı, ikinci hücre başına ortalama 6500 fotonlar kadar ifade, ancak ikinci hücre başına ortalama 500 fotonlar üzerindeki herhangi bir ifade seviyesi in vivo olarak başarıyla görüntülü olabilir. Şimdi uygun aktivite hücreleri olduğunu, subkutan enjeksiyon adıma geçebilirsiniz. Tümör optimum algılama kolaylaştırmak amacıyla, immün sistemi baskılanmış bir atimik çıplak fare suşu kullanıyor. Enjeksiyondan önce, hayvanlar derin anestezi için anestezi etkisi vardır. Sonra 100ul PBS içinde 250.000 hücrelerine enjekte edecektir kanadını içine subkutan enjekte edilir. 1 ml şırınga içinde hücreleri Yük ve 26 gauge iğne takın. Forseps bir "çadır" ve tabanda hücreler enjekte etmek için cildi hafifçe kaldırın. Yeni enjekte edilen hücrelerin hemen görüntülü olabilir. Her görüntüleme oturumda kg vücut ağırlığı başına luciferase toplam 150mg sonra periton boşluğuna iki enjeksiyon yoluyla uygulanır. Bu çalışmada, hayvanlar, tutarlı foton akısı sağlamak için luciferase enjeksiyondan sonra 10 dakika görüntülü. Biz bir sonraki adımda bunu göstereceğiz. Luciferase kinetik günden güne değişebilir. Bu model, luciferase enjeksiyondan sonra 10 dakika% 15 değişkenlik aralığında ölçüm sonucu verdi. Deneme için in vivo görüntüleme sistemi, arka inceltilmiş bir şarj bağlantılı aygıt ° C maksimum hassasiyet elde etmek için -90 soğutmalı kullanan IVIS Spektrum kullanacağız. Mutlak kantitatif desteklemek için, sistem aşağı-time sırasında karanlık şarj önlemleri ve başlatma sırasında kendi kendine kalibrasyon çalışır. Görüntüleme başlatmak için, IVIS sistemi başlatmak (tek tıklama) ve deney için görüntüleme parametrelerini ayarlamak. Görüntülü olan hayvanların sayısı için görüş alanını seçin. 5'e kadar hayvan cihazın ayrılmaz bir anestezik manifoldu kullanarak korunabilir. Aşamasında sabit bir 37 ° C hayvanlarda vücut ısısını korumak için. EKG portu stresli işlemleri sırasında hayvan sağlığı izlemek için sağlanır. Görüntü yazılım, maruz kalma süresi, f-stop ve piksel In Living binning hücre hattı ifade düzeyde göre optimize edilebilir. Bu ayarlar kantitatif sonuç etkilemeden bir deney sırasında herhangi bir zamanda değiştirilebilir. IVIS beyaz ışık ve görüntü üzerinde üst üste bir nicel bioluminescent veya floresan sinyali altında hayvan fotografik bir görüntü kazanır. Bioluminescent sinyali saniyede fotonlar ifade ve bir yoğunluk haritası olarak görüntülenir. Görüntü kantitatif etkilemeden görüntü optimum kontrast ve çözünürlük sağlamak için ayarlanır. Hücrelerden Lüminesans bir bölge faiz aracını kullanarak enjeksiyon yerinde ölçülebilir. Ölçüm verileri analiz için kaydedilir veya ihraç edilebilir bir görüntü yakalamak için ilgili tüm deneysel parametreleri ile birlikte tablo görüntülenir Çoklu görüntüleri elde ve deney doğa bağlı olarak saniye veya ay kapsayan boylamsal çalışmalar mukayese edilebilir. Biz zaman sıfır tümör foton akısı ölçmek ve iki haftalık aralıklarla görüntüleme ile 4 hafta boyunca izlemek. Foton akısı tümör biyoparlaklık tümör boyutu ile doğrudan ilişkili lusiferaz ifade canlı hücrelerin sayısı orantılıdır. 5 gün sonrası implantasyon az tümör henüz palpabl değil, ancak hücreleri biyoparlaklık ve aktif büyüyen bir tümör olduğu görüldü sayılabilir olabilir. Bu aşamada biyoparlaklık sinyal çok stronger. Maruz kalma süresi, f-stop ve piksel binning görüntü net ve kamera doyurabilecek değildir ki ayarlanabilir. Bu ölçümler deney daha önce ve daha sonra toplanan bu kıyaslanabilecek kadar IVIS ışık toplama değişiklikleri otomatik olarak dengeler. 7 gün yazılan implantasyon tümörler ölçüm veri zaten 7 gün üretilen ilk kez ve bioluminesans palpabl. 28 gün yazılan implantasyonu, tümörlerin nekrotik hale geliyor ve hücreler ölmeye başlar. Kaliper ölçümü ile tahmin Tümör boyutu kayda değer bir değişiklik değildir, ancak tümör lüminesans hücre ölümü belirten azalacak. Kaliper ölçümleri ve biyoparlaklık ölçüm, insani bir son nokta ulaşana kadar devam edilebilir. Hipoksi veya tedavi rejimleri nedeniyle tümör nekroz, tümör kitlesi azaltmak olmasa bile düşük biyoparlaklık tarafından belirtilecektir.