غير المشعة في الموقع تطبيق بروتوكول لتهجين شجرة التنوب النرويج ومجموعة من الأنواع النباتية

هذا هو الأمثل مرنا غير المشعة في البروتوكول الموقع التهجين للأنسجة الراتينجية النرويج وصفها بالتفصيل. ويستند ذلك على Arabidopsis / بذور اللفت في تهجين بروتوكول الموقع الأمثل في مجموعاتنا ، والتي بدورها تقوم على البروتوكولات من Meyerowitz ومختبرات الايرلندية والايرلندية التي كتبها فيفيان الأمثل ، لينكولن سيندي وجيف لونغ بين الآخرين 1-4. PROCEDURE 1. التثبيت وتضمينها لتوفير أنسجة الاحتفاظ RNA يجب أن تركز اهتمامها والمضمنة في الشمع قبل يتم إجراء تجربة في الموقع. التثبيت والتضمين هو خطوة حاسمة منذ مواد ثابتة سيئة قد تعطي إشارة منخفضة أو لا يمكن الكشف عنها حتى ولو مرنا وفيرة للغاية. الأنسجة والمجففة ، والتي تم تطهيرها وجزءا لا يتجزأ من الشمع في تغييرات تدريجية لتجنب تلف الأنسجة. لمزيد من الانكماش وتفادي تورم في خلايا يضاف كلوريد الصوديوم 0.85 ٪ إلى الخطوات الأولى في الإيثانول جفاف الأنسجة الراتينجية النرويج. فمن الممكن أن تترك لكلوريد الصوديوم في الإيثانول (على سبيل المثال فإنه لا يتبقى عليها في بروتوكول Arabidopsis / بذور اللفت). ويمكن تنفيذ الخطوة الجفاف خلال تضمين على الجليد للحفاظ على الحد الأدنى من النشاط في ريبونوكلياز أو على +4 درجة مئوية. في هذا البروتوكول الإصلاح بارافورمالدهيد 4 ٪ محلول يحتوي غلوتارالدهيد 0.25 ٪ ، والتي يفترض أن تعطي أفضل الاحتفاظ RNA رغم أن البعض يقول أنه يجعل الأرجح ، أي اختلاف (على سبيل المثال فإنه لا يتبقى عليها في بروتوكول Arabidopsis / بذور اللفت). الأكثر احتمالا يمكن أن تستخدم أي تثبيت القياسية وبروتوكول التضمين. ينظر إليها على أنها أقل من تضمين الراتينجية النرويج يختلف قليلا عن البروتوكول Arabidopsis / بذور اللفت. 1.1 يوم 1 مصنع تجميع المواد والتثبيت بارافورمالدهيد جمع المواد النباتية من الاهتمام وشرح إذا لزم الأمر. الحفاظ على الأنسجة على الجليد ووضعها في محلول الإصلاح الجليد الباردة (أنظر أدناه وصفات) مباشرة أو في أقرب وقت ممكن. ملحوظة! تبقي على الجليد في كل وقت! تطبق على عينات من فراغ حتى يبدأ في الغليان بارافورمالدهيد. عقد الفراغ لمدة تصل الى ثلاث ساعات (على سبيل المثال 2 × 15 دقيقة للArabidopsis اللفت والأنسجة النباتية أو ساعة واحدة عن مخاريط الصنوبر النرويج الذكور) والافراج عن فراغ ببطء. ومن المفترض أن يغرق في الأنسجة بعد الفراغ من عمليات التسلل تثبيتي ، ولكن لبعض الأنسجة التي تحتوي على الكثير من الهواء لم يكن ممكنا (Arabidopsis الزهور مثلا). ويمكن استخدام قطعة من الشاش لجعل البقاء في الأنسجة مثبت. استبدال تثبيتي ، واحتضان +4 درجات مئوية في الليل (~ 12-16 ساعة) يهز بلطف. الخيار 1 NB! النرويج الإصدار تضمين شجرة التنوب أدناه (الخطوات 4-8). جعل الأنابيب التلألؤ متأكدين أو تستخدم قوارير الزجاج ، على الأقل في الخطوة 5. 1.2 يوم 2 NB الجفاف! النرويج الإصدار الراتينجية التضمين. 0.85 ٪ كلوريد الصوديوم 30 دقيقة على الجليد 50 ٪ EtOH + كلوريد الصوديوم 0.85 ٪ 90 دقيقة على الجليد 70 ٪ EtOH + كلوريد الصوديوم 0.85 ٪ 90 دقيقة على الجليد وقفة! فمن الممكن أن تتوقف هنا وتخزينها في الأنسجة EtOH 70 ٪ + 0.85 ٪ كلوريد الصوديوم في +4 درجة مئوية لعدة أشهر. 85 ٪ EtOH + كلوريد الصوديوم 0.85 ٪ 90 دقيقة +4 درجة مئوية 95 EtOH ٪ (+ يوزين) 90 دقيقة +4 درجة مئوية NB! يضاف إلى يوزين صمة الأنسجة الوردي جعلها أسهل للكشف خلال دمج وsectioning ولكن قد يكون استبعاده. EtOH 100 ٪ (+ يوزين) 90 دقيقة +4 درجة مئوية EtOH 100 ٪ (+ يوزين) بين عشية وضحاها +4 درجة مئوية 1.3 يوم 3 الجفاف وتضمينها NB! النرويج الإصدار الراتينجية التضمين. <ol sتورتة = "5"> EtOH 100 ٪ (+ يوزين) ح 2 درجة حرارة الغرفة 50 ٪ + 50 ٪ EtOH Histoclear الثاني 1 ح درجة حرارة الغرفة 100 ٪ Histoclear الثاني 1 ح درجة حرارة الغرفة 100 ٪ Histoclear الثاني 1 ح درجة حرارة الغرفة 50 ٪ Histoclear Histowax الثاني + 50 ٪ بين عشية وضحاها 40-50 درجة مئوية NB! في الخطوة الأخيرة من تركيز Histowax ليس حاسما ، يصب فقط في بعض شرائح الشمع. 1.4 يوم 4 NB التضمين! النرويج الإصدار الراتينجية التضمين. 100 ٪ Histowax ذاب +60 درجة مئوية (في الصباح والمساء تغيير) 1.5 يوم 5 NB التضمين! النرويج الإصدار الراتينجية التضمين. 100 ٪ Histowax ذاب +60 درجة مئوية (في الصباح والمساء تغيير) 1.6 يوم 6 تضمينها NB! النرويج الإصدار الراتينجية التضمين. 100 ٪ Histowax ذاب +60 درجة مئوية (في الصباح والمساء تغيير) NB! فلا بأس إذا كان الشمع في بعض الأحيان يتم تغيير مرة واحدة في اليوم ، ولكن بعد ذلك يستغرق يومين لاستكمال يوم واحد من التغييرات. يمكن أيضا أن تواصل تغيير الشمع لمدة أيام إضافية دون مشكلة. هذا هو الموصى به لعينات كبيرة لأنها تساعد على التسلل من الشمع في وسط هذه الأنسجة. الخيار 2 NB! Arabidopsis / اللفت الإصدار تضمين أدناه (الخطوات 4-8). 1.2 يوم 2 NB الجفاف! Arabidopsis / اللفت الإصدار التضمين. NB! جميع الخطوات في +4 درجة مئوية ، والهز برفق ، إن لم يكن شيء يذكر. 1X PBS 30 دقيقة 1X PBS 30 دقيقة 30 ٪ EtOH 60 دقيقة 40 ٪ EtOH 60 دقيقة 50 ٪ EtOH 60 دقيقة 60 ٪ EtOH 60 دقيقة 70 ٪ EtOH 60 دقيقة وقفة! فمن الممكن أن تتوقف هنا وتخزينها في الأنسجة EtOH 70 ٪ في +4 درجة مئوية لعدة أشهر. 85 ٪ EtOH 60 دقيقة 95 EtOH ٪ (+ يوزين) بين عشية وضحاها NB! يضاف إلى يوزين صمة الأنسجة الوردي جعلها أسهل للكشف خلال دمج وsectioning ولكن قد يكون استبعاده. 1.3 يوم 3 الجفاف وembeddجي NB! Arabidopsis / اللفت الإصدار التضمين. NB! ويذكر جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة وتهتز برفق ، إن لم يكن آخر. EtOH 100 ٪ (+ يوزين) 30 دقيقة EtOH 100 ٪ (+ يوزين) 30 دقيقة EtOH 100 ٪ (+ يوزين) 60 دقيقة EtOH 100 ٪ (+ يوزين) 60 دقيقة NB! نقل الأنسجة لقوارير التلألؤ أو غيرها من قوارير (زجاج). 75 ٪ + 25 ٪ EtOH Histoclear الثاني 30 دقيقة 50 ٪ + 50 ٪ EtOH Histoclear الثاني 30 دقيقة 25 ٪ + 75 ٪ EtOH Histoclear الثاني 30 دقيقة 100 ٪ Histoclear الثاني 60 دقيقة 100 ٪ Histoclear الثاني 60 دقيقة 100 ٪ Histoclear الثاني + ربع حجم رقاقة Histowax بين عشية وضحاها (لا تهتز) NB! في الخطوة الأخيرة من تركيز Histowax ليس حاسما ، يصب فقط في بعض شرائح الشمع. 1.4 يوم 4 NB التضمين! Arabidopsis / اللفت الإصدار التضمين. ضع قارورة مع الأنسجة عند +42 درجة مئوية حتى يذوب الشمع رقائق تماما. إضافة القادم ¼ حجم رقائق الشمع والسماح لهم تذوب تماما. الانتقال إلى +60 درجة مئوية ، وترك قنينة لعدة ساعات. أخيرا ، استبدل الشمع / II Histoclear مع ذاب الشمع وطازجة خلال الليل في احتضان +60 درجة مئوية. 1.5 يوم 5 NB التضمين! Arabidopsis / اللفت الإصدار التضمين. 100 ٪ Histowax ذاب +60 درجة مئوية (في الصباح والمساء تغيير) 1.6 يوم 6 تضمينها NB! Arabidopsis / اللفت الإصدار التضمين. 100 ٪ Histowax ذاب +60 درجة مئوية (في الصباح والمساء تغيير) NB! في البروتوكول Arabidopsis / بذور اللفت (مقارنة بروتوكول الراتينجية النرويج) هناك يوم 7 تضمينها في الطريقة نفسها كما في يوم 06/05 ، أي بنسبة 100 ٪ Histowax ذاب في +60 درجة مئوية ، وتغيير في الصباح والمساء NB! فلا بأس إذا كان الشمع في بعض الأحيان يتم تغيير مرة واحدة في اليوم ، ولكن بعد ذلك يستغرق يومين لاستكمال يوم واحد من التغييرات. يمكن أيضا أن تواصل تغيير الشمع لمدة أيام إضافية دون مشكلة. هذا هو الموصى به لعينات كبيرة لأنها تساعد على التسلل من الشمع في وسط هذه الأنسجة. 1.7 يوم 7 تضمينها (يوم 8 في بروتوكول Arabidopsis / بذور اللفت) (وترد التفاصيل الفنية Film! في الفيلم) تسخين أطباق بتري و / أو في قوالب +60 درجة مئوية. بدوره على طبق ساخن (+60 درجة مئوية) وتأكد Histowax ذاب هو متاح. صب الأنسجة وHistowax ذاب في طبق بتري (أو القالب) توضع على طبق ساخن. إضافة المزيد من Histowax بحيث تتم تغطية الأنسجة. الحرارة زوج من ملاقط وتوزيعها بالتساوي على الأنسجة في الطبق. ملء طبق بتري (أو العفن). إذا الشمع يصلب قبل الأنسجة الموجودة في المكان المناسب ، الحرارة التي تصل مرة أخرى أو إزالة الشمع صلابة مع الزوج ساخنة من ملاقط. السماح للكتلة الشمع تتصلب في درجة حرارة الغرفة قبل وضعها في +4 درجة مئوية. فمن الأفضل لجعل كتل الشمع عدة بدلا من تضمين الأنسجة مسرف منذ كتلة الشمع قد تشن عندما يتم قطع قطعة من خلال sectioning. وقفة! مخزن في و+4درجة ؛ جيم الأنسجة في حالة مستقرة لسنوات. NB! ريبونوكلياز العمل خالية من هذه الخطوة وما بعده. استخدام القفازات وDEPC معاملة MilliQ المياه ، ومخازن ، والأواني الزجاجية وغيرها ، ومخازن الأوتوكلاف خبز الأواني الزجاجية الخ ، عند الاقتضاء. 2. SECTIONING (ترد تفاصيل Film! التقنية في الفيلم) بدوره على اثنين من الأطباق الساخنة (+60 درجة مئوية و +42 درجة مئوية) وتأكد Histowax ذاب هو متاح. الحرارة مشرط وقطع بعناية كتلة الشمع من نسيج طبق بتري (انها قد تشن إذا كان أحد غير عنيفة جدا) ، أو إزالته من القالب. عندما تم فصل الشمع كتلة واحدة ، وشكل القطعة الى الحجم المناسب والشكل لتسهيل تقطيع في مشراح. يجب أن يكون قطعة الشمع الشمع اضافي "كعب" تحت الأنسجة بحيث يمكن تركيبها على حامل كتلة. الحرارة صاحب كتلة وكعب على لوحة الساخن (+60 درجة مئوية) والصمامات معا. قد يكون من الضروري وضع على قطرة Histowax الثاني لجعل الانصهار مستقرة. اتركها تتصلب في +4 درجة مئوية. خفض كتلة الشمع إلى أقسام 6-8 ميكرون سميكة متصلة في شريط طويل باستخدام مشراح. NB! هذا سوف يكون أسهل إذا كانت كتلة الشمع البارد ، تخزين أي كتلة الشمع في +4 درجة مئوية ، وجعله من الثلاجة عند بدء تشغيل عدة قطاعات. يمكن أن يكون مفيدا أيضا للحفاظ على البرودة سكين. دراسة شرائط من المقاطع في العدسة المكبرة وتلك علامة لاستخدامه. وضع ريبونوكلياز خالية MilliQ المياه على الشرائح (دقق – Plus من فيشر في التكنولوجيا الحيوية ، والتي هي قبل تنظيفها ومشحونة). قص الشريط الى قطع صغيرة ووضعها ("العودة" أو "لامعة" الجانب السلبي) على الشرائح. يجب أن توضع الشرائح بشرائط على طبق من +42 درجة مئوية. يجب أن تتسطح خارج الشريط (وهذا هو المهم!) في الماء. اسمحوا المقاطع الجلوس لبضع دقائق ثم استخدام ورقة Kimwipe / الأنسجة لتصريف المياه. مغادرة الشرائح على لوحة لمدة 1-2 ساعات. احتضان الشرائح في +42 درجة مئوية خلال الليل بحيث تلتزم الأنسجة الشرائح. وقفة! فمن المستحسن استخدام المقاطع في أقرب وقت ممكن ، ولكن يمكن تخزينها جافة في صناديق مغلقة مع المجففة تصل إلى عدة أيام في +4 درجة مئوية. 3. THE MAKING تحقيقات التهجين في الموقع بالكشف عن التعبير باستخدام المسبار المسمى محددة لمرنا معينة. يمكن الموسومة المسبار ، الذي هو في معظم الأحيان قطعة من الحمض النووي الريبي مكملة ، مع digoxigenin ، وحفر. DIG هو جزيء صغير ، والتي يمكن تركيبها على يوريدين وأدرجت بالتالي في تحقيق RNA ومن ثم الكشف عن استخدام DIG محددة الأجسام المضادة. تصميم وصنع المسبار هي الخطوة الأكثر أهمية في الحمض النووي الريبي في تجربة التهجين الموقع. وينبغي توخي الحذر للتأكد من تحقيق نوعية عالية لديها ، والمسمى مع UTPs ذات جودة عالية. درجة الحرارة في بعض الأحيان التهجين و / أو طول رد فعل يجب أن تعدل لتحقيقات معينة. كما هو الحال دائما ، يجب توخي الحذر لتجنب ريبونوكلياز التلوث. قبل وضع العلامات ، وعزل قالب حسب البروتوكولات القياسية الخاصة بك ، واستخدام الحيوانات المستنسخة مثل [كدنا] ، شظايا PCR ، ويصبح خطي القالب. يتم عزل المعنى والعقاقير شظايا وتضخيمها من القالب باستخدام جين معين الاشعال. شظايا لتضخيم PCR لا تستخدم الإنزيمات التي تنتج يتدلى 3 '. لجميع أجزاء يضاف (أو SP6 أو T3) T7 المتراكمة باستخدام بادئات تحمل T7 تسلسل أو باستخدام ناقلات مع T7 – ​​المروج. بمعنى (مرنا أو (–) حبلا) تحقيقا لديهم تسلسل نفس الهدف مرنا وسوف لا يهجن مرنا إلى الهدف ، في حين أن العقاقير (المضادة للمرنا أو (+) حبلا) التحقيق لديها ، وبالتالي تسلسل متمم للهجن الهدف إعطاء إشارة من الاهتمام. ويستخدم المجس بالمعنى السلبي كعنصر تحكم ، وسوف يتم الحصول على أي إشارة إذا التجربة عملت بشكل صحيح. وهناك حاجة أيضا لمراقبة إيجابية ، على سبيل المثال تحقيقا يكشف الجين منزل وحفظ السلام. وينبغي المهجنة غالبية الشرائح مع تحقيقات العقاقير ، في حين ينبغي المهجنة سوى عدد قليل من الشرائح التحقيقات تحكم مختلفة. 3.1 توسيم دقق في استخدام النسخ المختبر تستخدم أو ما شابه ذلك عند وضع العلامات التحقيقات ؛ الكواشف من أدوات DIG صفها RNA (11175025910 ، روش العلوم التطبيقية ، مانهايم ، ألمانيا SP6/T7). ووصف رد فعل 20 ميكرولتر هنا ينبغي أن تسفر ~ 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي DIG المسمى. إجراء النسخ في المختبر لدمج النيوكليوتيدات المسمى. إضافة الكواشف التالية لأنبوب (إبقاء على الجليد) : عنصر الحجم / الكمية س 10 التوسيم NTP خليط 2 ميكرولتر س 10 العازلة النسخ 2 ميكرولتر حامي ريبونوكلياز المانع 1 ميكرولتر (20U) T7 بوليميريز الحمض النووي الريبي (SP6 أو T3) 2 ميكرولتر قالب الحمض النووي (500-1000 نانوغرام) س ميكرولتر ريبونوكلياز خالية MilliQ المياه ذ ميكرولتر ، إلى الحجم النهائي من 18 ميكرولتر مزيج الخليط العلامات NTP ، العازلة النسخ ، ريبونوكلياز المانع (NB! إذا كان التحقيق قصيرة ، على سبيل المثال <500bp ، قد تزيد من تركيز مثبط لريبونوكلياز 40U) ، البلمرة ، قالب الحمض النووي والماء ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة. احتضان هذا المزيج في رد فعل +37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة (إذا NB! التحقيق قصيرة ، على سبيل المثال <500bp ، وزيادة وقت رد الفعل إلى 4-6 ساعات). إضافة 2 ميكرولتر الدناز الأول واحتضان في +37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وقف رد الفعل بإضافة 2 ميكروليتر 0.2 M EDTA (8.0 درجة الحموضة). التحقق من المنتج على هلام. يعجل التحقيق بإضافة 2.5 ميكرولتر من LiCl M 4 و 75 ميكرولتر من الايثانول> 99.5 ٪. مزيج جيد واحتضان -20 درجة مئوية في الليل (NB! لا تستخدم الحمض الريبي النووي النقال والناقل. وبدلا من ذلك استخدام الجليكوجين أو وفقا للمادة الأكريلاميد المصنعين). الطرد المركزي (000 13 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في +4 درجة مئوية وإزالة طاف. غسل بيليه (على الأقل 10 دقيقة 13 000 دورة في الدقيقة) مرتين في الايثانول 70 ٪ (~ 150-300 ميكرولتر). إزالة طاف وترك الجافة بيليه. Resuspend التحقيق في 30 ريبونوكلياز المياه خالية ميكرولتر لمدة 1-2 ساعات على الثلج. وقفة! ويمكن تخزين التحقيق في -20 درجة مئوية لمدة أكثر من عام. NB! حفظ عينات 0.5 ميكرولتر من الخطوة 21 (قبل النسخ في المختبر) ، الخطوة 23 (قبل العلاج الدناز) ، الخطوة 24 (بعد العلاج الدناز ، ولكن قبل هطول الأمطار) و 1 ميكرولتر عينة من الخطوة 27 (عندما تم التحقيق معلق). تشغيل العينات على TBE هلام nondenaturating 1 ٪. إذا كان رد فعل الدناز عملت بشكل صحيح سوف القالب الفرقة تختفي. ينبغي أن النسخ المختبر في إنشاء فرقة RNA سميكة من حجم ما يقرب من الصحيح. إذا كنت ترى نطاقات متعددة ، denaturate العينات في +80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم التبريد على الجليد قبل التحميل. إذا كان الانتعاش من 27 خطوة يبدو سيئا قد يكون ذلك لأنه لم يتم التحقيق معلق أيضا. الحمض النووي الريبي في احتضان +55 درجة مئوية 5-10 دقائق للحصول عليه في الحل. 3.2 التحلل من تحقيقات طويلة NB! إذا يجب التحقيق الخاص هو أكبر من 150 سنة مضت أن تخفض إلى 50-150 الغليان إلى إعطاء إشارة عالية ، ويرجع ذلك إلى أفضل الاختراق. قد يكون التحقيق المتدهورة كيميائيا في منطقة عازلة كربونات (10.2 درجة الحموضة). إذا لجنة التحقيق هو من الحجم الصحيح تخطي الخطوة التحلل ، ولكن تذكر أن أضيف formamide الحجم ، أي 30 ميكرولتر ، إلى التحقيق. إعداد بيكربونات الصوديوم 0.2 M (NaHCO 3) وكربونات الصوديوم 0.2 M (نا 2 CO 3). وينبغي أن يكون كل من الطازجة. اختبار اثنين من مخازن خلط 5 مل O 2 H ، 2 مل 0،2 م 3 و 3 NaHCO 0.2 مل م نا 2 CO 3. وينبغي أن يكون الرقم الهيدروجيني ~ 10.2. حساب الوقت الحضانة : فترة حضانة (بالدقائق) = (L – L و 0) / (K * L * L و 0) L طول = 0 بدء التحقيق في كيلوبايت و L = الطول النهائي للجنة التحقيق في مثل = 0.100 كيلو بايت K = ثابت سرعة التحلل = 0.11 كيلوبايت ، 1min – 1 يتحلل نصف التحقيق الخاص ، حفظ الباقي لاحقا. تمييع التحقيق إلى 50 ميكرولتر بالماء ريبونوكلياز حرة وإضافة 20 ميكرولتر 0.2 M NaHCO 3 (إضافة أولى) و30 ميكرولتر 0.2 م نا 2 CO 3. خلط واحتضان في +60 درجة مئوية لفترة حضانة المحسوبة. وقف رد الفعل من خلال إضافة 10 ميكرولتر من 1 NaOAc M الرقم الهيدروجيني 4.7. يعجل التحقيق بإضافة 10 ميكرولتر 4 م 2 و 300 LiCl ethano ميكرولترل (NB! الجليكوجين أو استخدام مادة الأكريلاميد والناقل ، إذا لزم الأمر). في احتضان -20 درجة مئوية خلال الليل. الطرد المركزي (000 13 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة في +4 درجة مئوية وإزالة طاف. تغسل مرتين بيليه في الإيثانول 70 ٪ (~ 300 ميكرولتر). الطرد المركزي (000 13 دورة في الدقيقة) على الأقل 10 دقيقة في كل تغسل في +4 درجة مئوية. إزالة طاف وترك الجافة بيليه. Resuspend التحقيق في 30 ميكرولتر ريبونوكلياز خالية من المياه MilliQ. إضافة واحد formamide الحجم ، أي 30 ميكرولتر ، إلى التحقيق. وقفة! ويمكن تخزين التحقيق في -20 درجة مئوية لمدة أكثر من عام. NB! تأخذ 2 ميكرولتر من التحقيق unhydrolyzed و 2 ميكرولتر من التحقيق تحلل (قبل إضافة formamide) والاختيار على TBE هلام nondenaturating 1 ٪. يجب أن يكون هناك اختلاف في الحجم بين العينتين. قد تحتاج إلى تحقيقات في denaturated +80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم التبريد على الجليد قبل التحميل. 4. في الموقع التهجين (ترد تفاصيل Film! التقنية في الفيلم) تأكد من أن كافة الحلول ريبونوكلياز مجانا! فإنه ليس من الضروري DEPC معاملة كل شيء ، ولكن استخدام ما لا يقل عن تعقيمها MilliQ المياه. تأكد من أن يتم تسخين الأواني الزجاجية في جميع +200 درجة مئوية خلال الليل أو على الأقل لمدة 5 ساعات. علاج أوعية بلاستيكية ويحرك الحانات مع هيدروكسيد الصوديوم 0.1 M مع الهياج بين عشية وضحاها. شطف في حاويات من البلاستيك عدة مرات مع تعقيمها MilliQ المياه (~ 500 مل / حاوية). فمن الأهمية بمكان لشطف الحاويات بعناية لتجنب آثار هيدروكسيد الصوديوم التي قد تعكر صفو التهجين. DEPC معاملة جميع الحلول الأسهم ، باستثناء تريس – المخازن المؤقتة. وما تحقق من كل الحلول قبل بدء التجربة لضمان أن كل شيء متاح. حتى الخطوة 61 (باستثناء الخطوات 51-52) علينا أن نحافظ على الشرائح في الرف ، والتي يتم نقلها بسهولة بين الحاويات. 4.1 في المعالجة الموقعية القسم Deparaffinize / يذوى أقسام : 2X 10 دقيقة Histoclear الثاني (استخدام العبوات الزجاجية) 2X 1-2 EtOH دقيقة 100 ٪ 1-2 دقيقة EtOH 95 ٪ 1-2 دقيقة EtOH 90 ٪ 1-2 دقيقة EtOH 80 ٪ 1-2 دقيقة EtOH 60 ٪ 1-2 دقيقة EtOH 30 ٪ 1-2 دقيقة H 2 O تغسل الشرائح ل15-20 دقيقة في محكمة أمن الدولة 2X في درجة حرارة الغرفة (NB! تحضير بارافورمالدهيد المستخدمة في الخطوة 42 خلال فترة الحضانة). علاج الأنسجة لمدة 30 دقيقة مع بروتين في K +37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف (على سبيل المثال 1 ميكروغرام / مل Arabidopsis / اللفت و 3 ميكروغرام / مل لتجميل النرويج). وتسخين المزيج إلى +37 درجة مئوية 100 ملي تريس 8 أس هيدروجيني و 50 ملي EDTA. إضافة بروتين K مباشرة قبل معالجة الشرائح. ملحوظة! العلاج K بروتين يحتاج إلى أن يكون الأمثل اعتمادا على الأنسجة ، والأنواع النباتية والعمر. (NB! إعداد ثلاثي إلإيثانولامين المستخدمة في الخطوة 45 خلال فترة الحضانة). علاج الشرائح لمدة 2 دقيقة مع جليكاين 2mg/ml في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. (NB! اخلطي جليكاين مع برنامج تلفزيوني في اليوم قبل استخدامه للتأكد من أن يتم حلها بشكل صحيح جليكاين). تغسل الشرائح لمدة 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. تغسل الشرائح لمدة 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. احتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة مع 4 ٪ (W / V) بارافورمالدهيد (مصنوعة الطازجة) في 1X PBS الرقم الهيدروجيني 7 في درجة حرارة الغرفة. استخدام الحاويات الزجاجية. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. (الاستغناء أنهيدريد الخل الى حل في الخطوة 45). احتضان الشرائح لمدة 10 دقيقة في ثلاثي إلإيثانولامين 0.1M (مصنوعة الطازجة ، ودرجة الحموضة 8) ، وأنهيدريد الخليك في درجة حرارة الغرفة. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة. يذوى : 30 ثانية EtOH 30 ٪ 30 ثانية EtOH 60 ٪ 30 ثانية EtOH 80 ٪ 30 ثانية EtOH 90 ٪ 30 ثانية EtOH 95 ٪ 2X 30 ثانية EtOH 100 ٪ وقفة! فمن الممكن أن تتوقف هنا وتخزين الشرائح في وعاء مع كمية صغيرة من EtOH في القاع في +4 درجة مئوية لعدة ساعات. 4.2 في الموقع التهجين (ترد التفاصيل الفنية Film! في الفيلم) تقرر أي الشرائح لاستخدامها مع أي تحقيقات ، لا ننسى أن استخدام كل من المعنى وتحقيقات العقاقير ، فضلا عن مراقبة إيجابية. (NB! ProbeOn بلس الشرائح من التكنولوجيا الحيوية فيشر يملك صقيع الأبيض الذي يسمح لهم تقع في أزواج خلال الخطوات التهجين / الكشف عن البروتوكول.) ينبغي أن تستخدم نفس التحقيق مع نفس التركيز على زوج شريحة محددة. تحديد كيفية حل الكثير من التهجين لجعل على أساس العدد الإجمالي للأزواج الشريحة. تسخين كبريتات ديكستران في +60 درجة مئوية. الحل هو التهجين لزجة جدا من كبريتات ديكستران. وضعت الحل في التهجين +60 درجة مئوية ، وسوف يكون من الأسهل في التعامل معها. الهواء الجاف الشرائح على مناشف ورقية نظيفة أو أوراق Kimwipe / الأنسجة قبل تطبيق التحقيق. يجب أن تكون الشرائح يجف تماما. لكل زوج من الشرائح إضافة التحقيق. من المهم لاختبار تركيز التحقيق المختلفة (مثلا 0،5 و 2 و 4 ميكرولتر) للعثور على تركيز الأمثل قبل بريفورميد التجربة الفعلية. التهجين الحل أزواج الشريحة 5 أزواج الشريحة 10 أزواج الشريحة 15 أزواج الشريحة 20 10X الأملاح في الموقع 100 ميكرولتر 200 ميكرولتر 300 ميكرولتر 400 ميكرولتر منزوع الأيونات formamide 400 ميكرولتر 800 ميكرولتر 1200 ميكرولتر 1600 ميكرولتر 50 ٪ كبريتات ديكستران (+60 درجة مئوية) 200 ميكرولتر 400 ميكرولتر 600 ميكرولتر 800 ميكرولتر 50x دينهارت محلول 20 ميكرولتر 40 ميكرولتر 60 ميكرولتر 80 ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال (100mg/ml) 10 ميكرولتر 20 ميكرولتر 30 ميكرولتر 40 ميكرولتر H 2 O (DEPC المعالجة) 70 ميكرولتر 140 ميكرولتر 210 ميكرولتر 280 ميكرولتر اجمالى حجم 800 ميكرولتر 1600 ميكرولتر 2400 ميكرولتر 3200 ميكرولتر تمييع التحقيق في ريبونوكلياز خالية من المياه MilliQ إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. إضافة مجلد واحد (أي 20 ميكرولتر) formamide إلى التحقيق إعطاء حجم ما مجموعه 40 ميكرولتر. الحرارة التحقيق إلى 80 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. مكان على الجليد لمدة 2 دقيقة. تدور باستمرار. دقق في الحفاظ على الجليد. هذا التحقيق ، خليط غير كافية لزوج واحد من الشرائح. تتكاثر وفقا لعدد من أزواج لشريحة محددة في التحقيق. إضافة 160 ميكرولتر من محلول التهجين لكل زوج من الشرائح اعطاء الحجم النهائي من 200 ميكرولتر (أي حل التهجين 160 + 40 ميكرولتر التحقيق ميكرولتر) لكل زوج الشريحة. مزيج من دون توليد فقاعات. تحقيق لتطبيق شريحة واحدة وببطء فتيل الشرائح اثنين معا. (لا يمكن إلا أن يتم NB! الحصر ، مع دقق على الشرائح زائد ، أو ما يعادل الشرائح. إذا تم استخدام الشرائح دون صقيع استخدام قسائم بدلا من تغطية يقحم). رفع الشرائح أعلاه مناشف ورقية مبللة في وعاء من البلاستيك (التي الاختام بإحكام) باستخدام الماصات البلاستيكية. هجن 50-55 درجة مئوية خلال الليل (12-16 ساعة). 4.3 في الموقع التهجين آخر (ترد التفاصيل الفنية Film! في الفيلم) إعداد الموقع في التهجين آخر عن الاحترار ~ 2 L 0.2x SSC (+55 درجة مئوية) وL ~ 2 1X NTE (+37 درجة مئوية) بين عشية وضحاها. وهناك حاجة إلى مزيد من التعاون بين بلدان الجنوب وNTE إذا أجري العلاج ريبونوكلياز (الخطوات 57-59 أدناه). تراجع كل زوج الانزلاق الى SSC 0.2x الدافئة (راجع أعلاه) لفصل وشطف لهم. ثم ضع عليها في رف في حاويةمع SSC 0.2x الدافئة. تغسل الشرائح لمدة 60 دقيقة في محكمة أمن الدولة 0.2x مع التحريض على طيف +55 درجة مئوية. (NB! تحضير حل كتلة بورنغير المستخدمة في الخطوة 63 خلال فترة الحضانة). تكرار الغسيل في محكمة أمن الدولة لمدة 60 دقيقة 0.2x. (NB! إذا كان يتم تنفيذ الخطوة ريبونوكلياز السماح للذوبان ريبونوكلياز خلال هذه الحضانة ، إذا لم تستمر في الخطوة 60). اختياري : اغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في NTE 1X الدافئة (انظر أعلاه) في +37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. اختياري : كرر في غسل NTE 1X دافئة لمدة 5 دقائق مع agtation في +37 درجة مئوية لطيف. اختياري : علاج الشرائح مع ريبونوكلياز (20 ميكروغرام / مل ريبونوكلياز ألف في NTE 1X) لمدة 30 دقيقة في +37 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. ثم يغسل لمدة 5 دقائق في NTE 1X في التحريض لطيف مع +37 درجة مئوية. تكرار غسل NTE 1X. تغسل الشرائح لمدة 60 دقيقة في محكمة أمن الدولة في 0.2x +55 درجة مئوية مع الإثارة لطيف. (NB! تحضير حل كتلة المستخدمة في الخطوات 64-65 و 67 خلال فترة الحضانة). تغسل الشرائح لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني 1X في درجة حرارة الغرفة (Pause! تستطيع تخزين الشرائح في 1XPBS +4 درجات مئوية في الليل إذا كنت تريد الاستمرار في اليوم التالي). ضع الشرائح على الجزء السفلي من وعاء من البلاستيك كبير مع عينة تصل إلى جنب. احتضان الشرائح مع كتلة بورنغير 1 ٪ في 100 درجة الحموضة 7.5 ملي تريس ، 150 ملي مول كلوريد الصوديوم لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة لطيف. مجرد تغطية الشرائح مع الحل حظر. تخلصي من عرقلة الحل في حين أن الشرائح لا تزال في حاوية بلاستيكية أو مكان الشرائح في وعاء جديد. عندما تتدفق قبالة حل الشرائح تلتزم عادة إلى حاوية من البلاستيك ، ولكن تأكد من أنها لا تسقط من على الحاوية. استبدال حل كتلة بورنغير مع جيش صرب البوسنة 1.0 ٪ في 100 درجة الحموضة 7.5 ملي تريس ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، 0.3 ٪ تريتون X – 100. نفذ الحضانة كما في الخطوة 63. تمييع الأضداد المضادة للحفر (1:1250 ، أي 8 في جيش صرب البوسنة الأضداد ميكرولتر مل 10) في حل جيش صرب البوسنة / تريس / كلوريد الصوديوم / تريتون من 64 خطوة. جعل بركة من الأجسام المضادة في حل من البلاستيك وزن الطبق. ساندوتش شرائح معا للسماح للقوات الشعرية لسحب ما يصل إلى حل. استنزاف Kimwipe / المناديل الورقية وكرر ، في محاولة لتجنب الفقاعات. رفع الشرائح أعلاه مناشف ورقية مبللة في حاوية من البلاستيك والشرائح تسمح للجلوس على درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. استنزاف الشرائح على Kimwipe / المناديل الورقية ومنفصلة. مكان على الجزء السفلي من الحاويات البلاستيكية كما في الخطوة 63. غسل 4X في حل جيش صرب البوسنة / تريس / كلوريد الصوديوم / تريتون. 15 دقيقة في كل مرة ، والإثارة لطيف في درجة حرارة الغرفة. 10 دقيقة 100 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 9،5 ، و 100 ملي مول كلوريد الصوديوم ، و 50 ملي MgCl 2. مكان على الجزء السفلي من الحاويات البلاستيكية كما في الخطوة 63. تغسل الشريحة في تراجع الرقم الهيدروجيني تريس 2 9.5/NaCl/MgCl حل لضمان أن جميع من المنظفات قبالة. جعل السندويشات ، ووضع حل الزرقاء الغربية كما في 65. أكرر مرة واحدة. مكان الشرائح في وعاء من البلاستيك فوق مناشف ورقية مبللة في ظلام دامس (التفاف في احباط القصدير) لمدة 1-5 أيام في درجة حرارة الغرفة. الاختيار بعد 6 ساعات و 12 و 24 ثم مرة واحدة كل يوم. الشرائح هجرة ، وشطف في 1xTE لوقف التفاعل. وضعت على غلاف زلات قبل أن يتم فحص الشرائح في المجهر. يمكن حفظ الشرائح في TE 1X لعدة شهور ولكن التقاط الصور في أقرب وقت ممكن. RECIPES / حلول الأسهم NB! استخدام ريبونوكلياز خالية MilliQ المياه قدر الإمكان ، على سبيل المثال ، MilliQ DEPC علاج الماء (إضافة DEPC 0.1 ٪. اترك الأوتوكلاف بين عشية وضحاها. (20 دقيقة في 15 رطل ، أي 1.05 كغم / سم 2 ، وعلى دورة السائل) أو استخدامها في MilliQ الأقل تعقيمها بالماء عند إعداد مخازن والحلول الأسهم فإنه من الممكن أيضا أن يحل ريبونوكلياز خالية من الأملاح الموجودين في DEPC المياه المعالجة ، وبدلا من DEPC معاملة المخازن المؤقتة والحلول الاسهم أنفسهم ، وإذا كنت لا DEPC – معالجة المياه ، ومخازن والمخزون حلول ، على الأقل تعقيم الأوتوكلاف أو تصفية لهم. وقفة! مخازن وحلول تخزين المخزون في درجة حرارة الغرفة ، إن لم يكن شيء يذكر. NB! يمكنك أن تجد العديد من المخازن ، فضلا عن التلميحات حول كيفية جعلها في الاستنساخ الجزيئي (سامبروك ، J. ، وراسيل DW 2001. الاستنساخ الجزيئي دليل مختبر 3 الطبعه الربيع الباردة ميناء مختبر الصحافة ، الربيع الباردة هاربور ، نيويورك ، الولايات المتحدة). أنهيدريد الخليك ثلاثي إلإيثانولامين في 0.1M (الرقم الهيدروجيني 8 ، حجم : 800 مل). عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي ثلاثي إلإيثانولامين 10.4 مل 0.1 M ثلاثي إلإيثانولامين MilliQ المياه 786.4 مل حجم 800 مل النهائي حمض الهيدروكلوريك 3.2 مل منح درجة الحموضة8.0 أنهيدريد الخليك 4.8 مل 0.6 ٪ لجعل 0.1 M ثلاثي إلإيثانولامين العازلة ، ودرجة الحموضة 8.0 ، مخفف 10.4 مل من ثلاثي إلإيثانولامين في 786.4 مل من H 2 O وإضافة 3.2 مل من حمض الهيدروكلوريك لجلب الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 (تحقق مع مؤشر الرقم الهيدروجيني). رفع حامل الشرائح مع كسر ماصات بلاستيكية سعة 10 مل أو ما شابه ذلك في وعاء يحتوي على ثلاثي إلإيثانولامين مع شريط ضجة في القاع. الاستغناء عن 4.8 مل أنهيدريد الخليك ثلاثي إلإيثانولامين في بضع دقائق قبل وضع الشرائح في بحيث يتم مزجه جيدا. NB! جعل ثلاثي إلإيثانولامين 0.1M الطازجة وأنهيدريد الخل إضافة قبل الحضانة. NB! استخدام الحاويات الزجاجية. ثلاثي إلإيثانولامين العازلة لابد من استخدامها بسبب أنهيدريد الخليك غير مستقرة في الماء. Agarose (1 ٪) في جل TBE × 1 (الحجم : 100 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي Agarose 1 غرام 1 ٪ 1 × TBE ما يصل الى 100 مل مزيج agarose مع TBE × 1. الحرارة / يغلي حتى ذاب agarose. يلقي هلام. تشغيل هلام في منطقة عازلة TBE 1 س. كبريتات ديكستران 5 تمييع كبريتات ديكستران ز إلى 10 مل مع DEPC المعاملة MilliQ المياه (أي 50 ٪ (W / V)) ، وتذوب في 60 درجة مئوية. وقفة! المحل في -20 درجة مئوية. 0.5 M EDTA pH8.0 (titriplex الثالث ، سعة 500 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي EDTA (372.24 جم / مول) ز 93.06 0.5 M EDTA MilliQ المياه يصل الى 500 مل هيدروكسيد الصوديوم ~ 10 ز الكريات منح درجة الحموضة 8.0 DEPC 0.5 مل 0.1 ٪ DEPC تذوب في الماء EDTA (يحدث عند pH 8.0) ، وضبط لحجم النهائي من 500 مل. إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. الإصلاح حل / تثبيتي (الخطوات 1-3 ، 42) — 4 ٪ (ث / ت) في برنامج تلفزيوني بارافورمالدهيد 1X ، ودرجة الحموضة 7.0 (650 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي MilliQ المياه 585 مل 10X PBS 65 مل 1X PBS 10M هيدروكسيد الصوديوم 520 ميكرولتر منح درجة الحموضة ~ 11 بارافورمالدهيد 26 ز 4 ٪ يتركز حامض الهيدروكلوريك 449 ميكرولتر منح درجة الحموضة ~ 7 مزيج الماء ، برنامج تلفزيوني ، وهيدروكسيد الصوديوم والحرارة الى 60-70 درجة مئوية (درجة الحرارة ودرجة الحموضة المرتفعة سوف تجعل من الأسهل حل بارافورمالدهيد. إضافة (هود في الدخان) بارافورمالدهيد. عندما حل برأ وضعه على الجليد وضبط درجة الحموضة إلى 7.0 بإضافة حمض الهيدروكلوريك تتركز 449 ميكرولتر. NB! جعل الطازجة. NB! في غلوتارالدهيد بروتوكول شجرة التنوب وأضيف إلى تركيز النهائي من 0.25 ٪ ، أي 6.5 مل غلوتارالدهيد 25 ٪ من إجمالي حجم 650 مل أو 10 مل غلوتارالدهيد 25 ٪ من إجمالي حجم مل 1000 (تذكر للحد من الماء مع المساواة الحجم). NB! إضافة بضع قطرات من توين 20 و / أو تريتون X – 100 ، بعد تعديل درجة الحموضة ، للحد من التوتر السطحي لتسهيل التثبيت في الخطوات 1-3. DO NOT USE في الخطوة 42! NB! وهناك حاجة عموما تثبيتي — عند تحديد الأنسجة النباتية أصغر حجم (200 مل مثلا 100). 10X الأملاح في الموقع (حجم 100 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي 5 M كلوريد الصوديوم 60 مل 3M كلوريد الصوديوم 1 M – CL تريس 8.0 درجة الحموضة 10 مل 0.100 M تريس 1 م نا الفوسفات 6.8 درجة الحموضة 10 مل 0.100 م نا الفوسفات 0.5 M EDTA 10 مل 0.050 M EDTA MilliQ المياه ما يصل الى 100 مل مزيج العازلة فوسفات الصوديوم مع 6.8 درجة الحموضة (46.3 مل 1 م 2 نا هبو 4 + 1 مل 53.7 م 2 ص ناه 4). مزيج كلوريد الصوديوم ، تريس ، فوسفات الصوديوم العازلة ، EDTA والمياه. الأوتوكلاف. قفة! المحل في -20 درجة مئوية. 4 M LiCl 2 (كلوريد الليثيوم ، وحجم التداول : 100 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي LiCl 2 (42.39 جم / مول) 16.956 ز 4M LiCl 2 MilliQ المياه ما يصل الى 100 مل DEPC 0.1 مل 0.1 ٪ DEPC حل LiCl 2 في الماء ، والتكيف مع الحجم النهائي من 100 مل. إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. وقفة! في مخزن +4 درجة مئوية. 1 م 2 · MgCl H 2 O (كلوريد المغنيسيوم ، وحجم التداول : 100 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي MgCl 2 · H 2 O (203.30 جم / مول) ز 20.33 1 م 2 · MgCl H 2 O MilliQ المياه ما يصل الى 100 مل DEPC 0.1 مل 0.1 ٪ DEPC حل MgCl 2 في الماء ، والتكيف مع الحجم النهائي من 100 مل. إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. NB! MgCl 2 هو استرطابي جدا. لا تقم بتخزين الزجاجات فتح لفترات طويلة من الزمن. 5 M كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ، وحجم التداول : 1 لتر) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي كلوريد الصوديوم (58.44 جم / مول) 292.2 ز 5 M كلوريد الصوديوم MilliQ المياه حتى 1L DEPC 1 مل 0.1 ٪ DEPC كلوريد الصوديوم تذوب في الماء ، والتكيف مع حجم 1 لتر النهائي إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. 1 م NaOAc 4.7 درجة الحموضة (خلات الصوديوم ، حجم التداول : 100 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي NaOAc (82.03 جم / مول) 0.8203 ز 1 م NaOAc MilliQ المياه ما يصل الى 100 مل حامض الخليك منح درجة الحموضة 4.7 DEPC 0.1 مل 0.1 ٪ DEPC NaOAc حل في الماء. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 4.7. التكيف مع الحجم النهائي من 100 مل. إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. 0.2 م 2 CO 3 نا pH11.4 (كربونات الصوديوم ، وحجم : 10 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي غ 2 CO 3 </suب> 0.21198 ز 0.2 M نا 2 CO 3 = 11،4 درجة الحموضة MilliQ المياه ما يصل الى 10 مل حل نا 2 CO 3 في الماء ، لضبط الحجم النهائي من 10 مل. وينبغي أن يكون الرقم الهيدروجيني 11.4. NB! جعل الطازجة. 0.2 م 3 NaHCO pH8.2 (بيكربونات الصوديوم ، وحجم : 10 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي NaHCO 3 0.16802 ز 0.2 M NaHCO 3 : الرقم الهيدروجيني = 8.2 MilliQ المياه ما يصل الى 10 مل تذوب في الماء NaHCO 3 ؛ على التكيف مع الحجم النهائي من 10 مل. وينبغي أن يكون الرقم الهيدروجيني 8.2. NB! جعل الطازجة. 1 م 2 نا هبو 4 · 2 H 2 O (حجم 500 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي غ 2 هبو 4 · 2 H 2 O (177.99 جم / مول) 88.995 ز 1 م 2 نا هبو 4 MilliQ المياه يصل الى 500 مل DEPC 0.5 مل 0.1 ٪ DEPC حل نا 2 هبو 4 في المياه ، والتكيف مع الحجم النهائي من 500 مل. إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. 1 م 2 ص ناه 4 · H 2 O (حجم 500 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي ناه 2 ص 4 · H 2 O (137.99 جم / مول) 68.995 ز 1 م 2 ص 4 ناه MilliQ المياه يصل الى 500 مل DEPC 0.5 مل 0.1 ٪ DEPC حل ناه 2 ص 4 في المياه ، والتكيف مع الحجم النهائي من 500 مل. إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. 5X NTE (الحجم الكلي : 1L) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي 5 M كلوريد الصوديوم 500 مل كلوريد الصوديوم 2.5 M 1 M – CL تريس 8 أس هيدروجيني 25 مل 50 ملي تريس – CL 8 أس هيدروجيني 0.5 M EDTA 5 مل 5 ملم EDTA MilliQ المياه 470 مل نهائي حجم 1L مزيج كلوريد الصوديوم ، تريس ، EDTA والمياه. لا DEPC معاملة. الأوتوكلاف. 10 × PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) الرقم الهيدروجيني 7.0 (الحجم الكلي : 1L) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي 5 M كلوريد الصوديوم 260 مل كلوريد الصوديوم 1.3 M 1 م 2 نا هبو 4 70 مل 70 ملم نا 2 4 هبو 1 م 2 ص 4 ناه 30 مل 30 ملم ناه 2 ص 4 MilliQ المياه 640 مل نهائي حجم 1L DEPC 1 مل 0.1 ٪ DEPC مزيج كلوريد الصوديوم ، نا 2 هبو 4 ، 2 ص 4 ناه والمياه. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك. إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. 20X SSC درجة الحموضة 7.0 (الحجم الكلي : 1L) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي كلوريد الصوديوم (58.44 جم / مول) ز 175.32 3 M كلوريد الصوديوم غ السيترات (294.1 غرام / مول) ز 88.23 0.300 م السيترات نا MilliQ المياه يصل إلى 1 لتر حمض الهيدروكلوريك منح درجة الحموضة 7.5 DEPC 1 مل 0.1 ٪ DEPC وكلوريد الصوديوم تذوب في الماء نا السيترات ~ مل 800. ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك. ضبط مستوى الصوت إلى 1 لتر من الماء. إضافة DEPC 0.1 ٪. يترك طوال الليل. الأوتوكلاف. 5 × TBE (الحجم : 1L) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي تريس (121.14 جم / مول) 54 ز ~ 0.45 M تريس حمض البوريك (61.83 جم / مول) 27.5 ز ~ 0.45 M حمض البوريك EDTA (372.24 جم / مول) 3.7 غرام ~ 0.01 M EDTA MilliQ المياه حتى 1L مزيج تريس ، حمض البوريك ، EDTA والمياه. وينبغي أن يكون الرقم الهيدروجيني ~ 8.3. لتمييع TBE × 1 قبل الاستخدام. 10 × 8.0 TE الرقم الهيدروجيني (تريس EDTA ، حجم التداول : 1L) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي 1 M – CL تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 100 مل 0.100 M – CL تريس 0.5 M EDTA pH8.0 100 مل 0.050 M EDTA MilliQ المياه حتى 1L مزيج تريس ، EDTA والمياه. لا DEPC معاملة. الأوتوكلاف. NB! وينبغي أن لا يكون تريس DEPC المعاملة! استخدام ريبونوكلياز خالية من مسحوق وتمييع مع DEPC-treated/RNase-free MilliQ المياه. M – 1 تريس الرقم الهيدروجيني حمض الهيدروكلوريك 7،5-9،5 (حجم 500 مل) عنصر الحجم / الكمية التركيز النهائي تريس (121.14 جم / مول) ز 60.57 1 م تريس MilliQ المياه يصل الى 500 مل حمض الهيدروكلوريك منح درجة الحموضة 7.5 حمض الهيدروكلوريك منح درجة الحموضة 8.0 هيدروكسيد الصوديوم منح درجة الحموضة 9.5 تذوب في تريس DEPC معاملة المياه. التكيف مع درجة الحموضة المطلوبة. التكيف مع الحجم النهائي من 500 مل. الأوتوكلاف. NB! وينبغي أن لا يكون تريس DEPC المعاملة! استخدام ريبونوكلياز خالية من مسحوق وتمييع مع DEPC-treated/RNase-free MilliQ المياه. NB! في الاستنساخ الجزيئي (انظر أعلاه) وجود جدول تصف مدى تركيز حمض الهيدروكلوريك وهناك حاجة لتحقيق درجة الحموضة الصحيح. المواد والأساليب وقدم في البروتوكول الموقع أعلاه وفي الفيلم. موصوفة هنا معلومات إضافية من المواد النباتية والمجسات المستخدمة في هذا المثال معينة. المواد النباتية والتصميم التجريبي المخاريط من الذكور abies Picea [L.] كارست. (النرويج شجرة التنوب) جمعت في أوبسالا ، السويد ، خريف 2007. وكان ثمانية المخاريط مقطوع ومقاطع منواستخدمت كل مخروط في كل معاملة. تم اختبار ثلاثة تركيزات بروتين كاف ؛ عولجوا 1 و 3 و 5 ميكروغرام / ميكرولتر وتركيز كل مع أو بدون ريبونوكلياز. تركت الشرائح لا تعامل مع ريبونوكلياز في برنامج تلفزيوني أثناء العلاج ريبونوكلياز. thaliana Arabidopsis [ل] Heynh. وكانت تزرع الكرنب napus L. ، في ظل ظروف رقابة في دائرة الثقافة مع 22 ° C/18 ° C يوم / ليلة درجات الحرارة والإضاءة من 16 ساعة. درست inflorescences الشباب تحتوي على البراعم الزهرية ، ومراحل 00-10 (مراحل وفقا لسميث 5). تحقيقات كرنا تم عزل الحمض النووي الريبي من مجموع P. المخاريط abies الذكور كما هو موضح سابقا (6) وألف من thaliana وباء. napus باستخدام TRIzol (Gibco BRL ، فريدريك ، بولاية ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية) وRNeasy Qiagen النبات البسيطة كيت (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) ، على التوالي ، وفقا لتوصيات الصانعين. تم تصنيعه من [كدنا] 0،5-1 الحمض النووي الريبي مجموع ميكروغرام ، حسب الأنواع ، وذلك باستخدام مرتفع الثالث عكس الناسخ (Invitrogen ، كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. AtAP3 BnAP3 والحس وشظايا والعقاقير P. وقد تم عزل شظايا وتضخيم الشعور abies باستخدام جين معين الاشعال (الجدول 1). تم عزل شظايا العقاقير DAL13 وتضخيم كما هو الحال في استخدام أجهزة الاشعال 7. وأضيف إلى عبء T7 شظايا من ألف وthaliana P. abies باستخدام بادئات عكس تعديل تحمل T7 تسلسل (الجدول 1). تم عزل 500 ألف قطعة من غليان BnAP3 باستخدام بادئات محددة (الجدول 1) والمستنسخة في ناقلات pGEM – T – T7 مع promotor. لabies P. شظايا أجريت جميع تفاعلات PCR في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر تحتوي على 0.2 U Phusion الرفيع 0.3 ميكرومتر Fidility الحمض النووي بوليميريز (Finnzymes ، إسبو ، فنلندا) ، 1X Phusion HF العازلة ، و 200 ميكرومتر لكل dNTP ، كل وقد استخدم التمهيدي و25-50 نانوغرام [كدنا] وبرنامج PCR القياسية مع الصلب درجة الحرارة 60-55 درجة مئوية (لمس أسفل -1 ° C / دورة) ، يليه بنسبة 55 درجة مئوية. وتوليفها والشعور العقاقير تحقيقات كرنا لجميع الأنواع الثلاثة مع النسخ في المختبر باستخدام الحمض النووي الريبي DIG صفها كيت (SP6/T7 ؛ روش العلوم التطبيقية ، مانهايم ، ألمانيا) وفقا لتوصيات الشركة الصانعة وتحقيقات طويلة وهضم ما يقرب من 100-150 سنة مضت شظايا باستخدام نا 2 CO 3 العازلة وفقا ل3. النتائج هنا في القسم ونحن تصف نتيجة ثلاثة أمثلة مختلفة من النتائج في تجارب نموذجية من الموقع. الآلية الوراثية التي تنظم التنمية الإنجابية في عاريات البذور وكاسيات البذور عن طريق تحديد هوية الجهاز الذكور والإناث على ما يبدو 7-9 الحفاظ على الرغم من التطور أن المصنع فصل البذور سلالتين 285000000 10 عاما مضت. في ألف thaliana جينات نباتية homeotic APETALA3 (AP3 11) وPISTILLATA (PI 12) ضرورية وكافية لتحديد وضع التناسلية للذكور في سياق زهرة ، وهذه الوظيفة يبدو أن الحفظ داخل كاسية البذور النسب 13. في عاريات البذور ، والتي تفتقر لها الزهور وأعضائهم التناسلية مرتبة في مخاريط منفصلة من الذكور والإناث (الشكل 1A – C) ، يتم التعبير عن الجينات تحديدا مثلي لAP3 وPI في الأجهزة التي تحمل حبوب اللقاح من مخروط من الذكور ، microsporophylls 7،14. وبالتالي ، مجموعة مماثلة من جينات متماثلة في كلا كاسيات عاريات البذور ويحدد الأجهزة التي تحمل حبوب اللقاح. أعطى تحقيقات جين معين وموجه ضد AtAP3 BnAP3 ، على التوالي ، وإشارات من مرحلة البراعم الزهرية 3 في الشباب في المنطقة المقابلة لدوارة اثنين وثلاثة في A. thaliana وباء. napus. في وقت لاحق قام براعم اقتصرت على إشارات إلى بتلات النامية والأسدية (الشكل 2A وباء). هذه النتائج تتفق مع نتائج الدراسات السابقة 11،15،16. تحقيقات الموجهة نحو نديد AP3 في P. أنتجت abies ، DAL13 ، وإشارات في microsporophylls من P. المخاريط abies الذكور على حد سواء قبل وبعد انتهاء النسيج الإنشائي القمي (الشكل 2C و D) ، كما هو متوقع من الدراسات السابقة 7،14. أعطى تحقيقات بمعنى عدم وجود إشارة أعلاه الخلفية (الشكل 3A – B والبيانات لا تظهر). أخذت معا ، وهذه النتائج تدل على مدى التعبير عن ألف AP3 thaliana وorthologs في B. وnapus P. abies في تطوير الأجهزة التناسلية للذكور. الشكل 1. A.thaliana وباء. napus الزهور وحبوب اللقاح المنتجة المخاريط من الذكور P. الصنوبرية. صور abies تظهر البراعم الزهرية inflorescences مع والزهور المفتوحة A.thaliana وB.napuق في ألف وباء على التوالي. علما بأن الزهور كاسية البذور وبصرف النظر عن غلاف الزهرة العقيمة المرافئ الأعضاء التناسلية للذكور والإناث على حد سواء ؛ الأسدية والكرابل. هو موضح في C هو غصين من P. عارية البذور abies مع الإبر النباتي الأخضر والأحمر المخاريط الذكور الإنجابية. الشكل 2. التعبير أ. AP3 thaliana وجينات متماثلة في B. وnapus P. abies. Micrographs تظهر المقاطع الطولية أ. thaliana وباء. napus في inflorescences على التوالي ، A و B و P. ذكر المخاريط abies في C و D. أقسام المهجنة مع تحقيقات العقاقير الموجهة ضد AtAP3 في ألف وباء BnAP3 في اشارة تظهر في الأجهزة الثاني والثالث من الزهور دوارة. الأرقام تشير إلى مراحل الأزهار وفقا لسميث 5. أعطى العقاقير الموجهة نحو تحقيق هذا الجين في إشارة DAL13 microsporophylls تحمل حبوب اللقاح من P. ذكر المخاريط abies ، كما هو مبين في مؤتمر نزع السلاح. يشار إلى أمثلة microsporophylls بأسهم. النصال في النقطة م للإشارة إلى التهجين ، والذي يظهر كما الأرجواني. في C و D مركبات الفينول يعطي اللون البني غير محددة إلى الخلايا الفردية في باب المركزية. ق ، كأسية ؛ ع ، بتلة ؛ الحادي والعشرين ، السداة ، ج ، خباء ، مللي ، microsporophyll ؛ بي ، لباب ، PP ، قبل لقاح الخلايا. شريط : 100 ميكرومتر. الشكل 3. DAL13 التعبير في مخاريط من الذكور P. abies. جميع Micrographs (ه) ، تظهر المقاطع الطولية للمخاريط الذكور بعد انتهاء النسيج الإنشائي القمي. السهام تشير إلى أنواع الخلايا التي يتم التعبير DAL13. والمهجنة المقاطع في ألف وباء وبإحساس التحقيق التحكم لتحديد تلوين الخلفية. والمهجنة Micrographs C إلى H مع التحقيق الذي تجريه DAL13 العقاقير. وتظهر مقاطع من التجارب مع وبدون علاج في ريبونوكلياز D ، F ، H و C ، E ، G على التوالي. وتظهر التجارب مع Micrographs من 1 ميكروغرام / مل K بروتين في C و D و 3 ميكروغرام / مل في E و F ، و 5 ميكروغرام / مل في شريط G و H. : 100 ميكرومتر.