该视频演示如何啉或mRNA可以注射到斑马鱼的胚胎,在单细胞阶段减少或增加特定的基因产物在随后的发展水平。
研究斑马鱼的优点之一是操纵在胚胎中的蛋白质水平的易用性和速度。 Morpholinos,这是与靶RNA的合成寡核苷酸反义互补,可以添加到胚胎,以减少一个特定的基因产物的表达。相反,处理的mRNA可以添加到胚胎,增加一个基因产物的水平。车辆无论是基因或吗啉胚胎显微注射。显微注射是高效,快速,让数百个胚胎每小时注入。该视频显示在显微注射的所有步骤。简单地说,鸡蛋收集后立即被解雇,一字排开反对在培养皿中的显微镜幻灯片。下一步,注射材料装入了一种细尖的针是连接到一个微量空气源,并微量控制的调整,以产生一个理想的注射量。最后,针陷入胚胎的卵黄和吗啉或mRNA被驱逐。
斑马鱼模型系统的优势之一是与特定的基因产物可以添加或从胚胎显微注射所淘汰的缓解。无所不在的过度表达一种特定的蛋白质,mRNA编码是注入蛋黄1细胞阶段。在胚胎的后续发展,RNA是分布在整个生物体和翻译。相反,要消除一种特定的蛋白质,morpholinos使用。 Morpholinos是与特定的RNA的反义互补性,设计合成寡核苷酸。一样的mRNA,morpholinos注入蛋黄1细胞阶段。在胚胎里,他们结合自己的靶RNA,防止翻译。
主要的修改,需要为每个啉或mRNA注射材料的浓度。过高的浓度啉或表达可能导致非特异性的毒性,而每个啉必须的实证检验,以确定其最佳浓度,通常啉浓度200微米,500微米之间的基因的活动有效地击倒,而不会造成非特异性缺陷。针开放精确的尺寸并不重要。针头大小的范围内,注射压力和注射时间内可以进行调整,以产生正确的卷丸。
Morpholinos有许多应用,包括域范围内的一种蛋白质的功能夹层。设计针对特定的外显子 – 内含子路口时,morpholinos防止发生有拼接。我们研究了两个morpholinos的影响,结合外显子-内含子在mRNA前体的 HEG的交界处。啉heg_e3i3_egfr1结合的第3外显子和内含子3之间的交界处,防止纳入成熟笔录第3外显子剪接机器。吗啉heg_e4i4_egfr2同样删除第4外显子。外显子3和4都含有EGF样重复编码域。有些胚胎注入heg_e4i4_egfr2中等型模拟突变,将需要进一步的实验,以了解HEG第4外显子在心脏发育中的作用。令人惊讶的是,与heg_e3i3_egfr1注射的胚胎脑水肿,HEG突变体的功能。这可能是由于morpholinos能力结合产妇的成绩单将在合子突变体的影响。
我们承认他们的技术援助马布利实验室和Narie斯托勒成员,和美国心脏协会(NCRP的科学家开发格兰特0635363N)和国家心脏,肺和血液研究所(批准SCCOR射频消融HL02 – 027)提供资金。