Während die erste Phase der Glykolyse Energie verbraucht, um Glucose in Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) umzuwandeln, produziert die zweite Phase Energie. Die Energie wird in eine Reihe von Reaktionen freigesetzt. Dabei wird GAP in Pyruvat umgewandelt. Die energiefreisetzende Phase (Schritte 6-10 der Glykolyse) erfolgt zweimal. Sie läuft nämlich für jeden der beiden 3-Kohlenstoffzucker ab, die während der Schritte 1-5 produziert worden sind.
Der erste energiefreisetzende Schritt (der 6. Schritt der Glykolyse) besteht aus zwei gleichzeitigen Ereignissen: Die Oxidation und Phosphorylierung von GAP. Der Elektronenträger NAD+ entfernt einen Wasserstoff aus GAP, oxidiert den 3-Kohlenstoffzucker und wandelt (reduziert) NAD+ in NADH und H+ um. Die freigesetzte Energie wird genutzt, um GAP zu phosphorylieren und in 1,3-Bisphosphoglycerat umzuwandeln.
Im nächsten Schritt wandelt 1,3-Bisphosphoglycerat ADP in ATP, durch die Abgabe einer Phosphatgruppe, um. Dabei wird 3-Phosphoglycerat gebildet. Das 3-Phosphoglycerat wird dann in ein Isomer, 2-Phosphoglycerat, umgewandelt.
Nachfolgend verliert 2-Phosphoglycerat ein Wassermolekül und wird zu dem instabilen Molekül 2-Phosphoenolpyruvat oder PEP. PEP gibt seine Phosphatgruppe leicht an ADP ab, wandelt es in ein zweites ATP-Molekül um, wobei Pyruvat gebildet wird.
In der Energiefreisetzungsphase werden pro umgewandelten Zucker zwei Moleküle ATP und ein Molekül NADH freigesetzt. Da während der energieverbrauchenden Phase der Glykolyse zwei 3-Kohlenstoff-Zucker produziert wurden, findet dies doppelt statt. Es werden also vier ATP-Moleküle und zwei NADH-Moleküle freigesetzt. So ergibt die Glykolyse für jedes Glukosemolekül eine Nettoproduktion von zwei ATP-Molekülen (4 produziert minus 2 verbraucht, während der energieaufwendigen Phase) und zwei NADH-Molekülen.
Glykolyse produziert zwei 3-Kohlenstoff-Pyruvat-Moleküle aus einem 6-Kohlenstoff-Glucosemolekül. In Gegenwart von Sauerstoff kann Pyruvat im Krebszyklus in Kohlenstoffdioxid zerlegt werden, wobei viele ATP-Moleküle freigesetzt werden. NADH sammelt sich in der Zelle an, wo es wieder in NAD+ umgewandelt werden kann und für weitere Kreislaufe der Glykolyse verwendet werden kann.
