Artım çekirdeklerini örneklemek ve dijitalleştirmek için yeni bir iş akışı
Summary
Artımlı çekirdekleri ambalajından çıkarıp ahşap montajlara yapıştırmaya gerek kalmadan sahada sabitlemek için 3D baskılı montajları kullanmak için bir protokol sunuyoruz. Yeni GSC tutucu, çekirdeklerin yüzeylerini kesmek ve bunları doğrudan dijital görüntü yakalamaya aktarmak için bir çekirdek mikrotomuna yerleştirilmesine izin verir.
Abstract
Burada, sahadaki artımlı karotların alınmasından, depolanmasından ve laboratuvara taşınmasından, sonraki dendroekolojik analizler için daha fazla analiz için ağaç halkalarının sayısallaştırılmasına kadar yeni bir iş akışı sunuyoruz. Prosedür, artımlı çekirdekler için yeni numune taşıyıcılarının kullanılmasını içerir. Bu yeni Gärtner Schneider Core (GSC) tutucular, üç boyutlu (3D) modelleme yazılımı kullanılarak tasarlandı ve son olarak bir 3D yazıcı ile basıldı. Bu montajları sahada en baştan kullanarak, çekirdekler doğrudan bir çekirdek mikrotomu ile kesilebilir ve yüzeyleri daha sonra yeni bir yüksek çözünürlüklü görüntü yakalama sistemi kullanılarak daha fazla yeniden düzenleme yapılmadan sayısallaştırılabilir. Bu nedenle doğrudan analiz için kullanılabilirler. Bu sistem, ağaç halkalarının çekirdeklerden ve disklerden sayısallaştırılmasına ve ayrıca iletilen ışığı kullanarak uzun mikro kesitlerden (40 cm’ye kadar) görüntü alınmasına olanak tanır. Bu özellik, bir çekirdek mikrotomu ile kesilen mikro kesitlerde herhangi bir bozulmanın başlangıcını tanımlamak için dendroekolojik ve jeomorfik uygulamalar için özel bir ilgi alanıdır.
Introduction
Ağaç halkalarının çapraz tarihleme tekniği uygulanarak tarihlendirilmesi ilkesi ilk kez 1881 yılında Avusturyalı orman bilimci Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudent tarafından ortaya atılmıştır1. 20.yüzyılın ilk yarısında, bu teknik, arkeolojik alanların ve yaşayan ağaçların tarihlendirilmesinde yoğun bir şekilde uygulayan “Dendrokronolojinin Babası” Andrew Ellicott Douglass tarafından yeniden icat edildi2.
Günümüzde, dendrokronolojinin bir tür çevresel çerçevesi olarak hareket eden araştırma konusu olan dendroekoloji, ağaç halkalarının ve zaman içindeki ekolojik ve çevresel değişikliklerin neden olduğu doğal büyüme varyasyonlarının incelenmesi olarak tanımlanmaktadır3. Dendroekolojik araştırmalarda, çevreselkoşulların zaman içinde ağaç büyümesi üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için bu verileri çevresel parametrelerle ilişkilendirmek için kararlı izotoplar, geç odun yoğunluğu veya tek halkalar içindeki hücre özellikleri gibi halka genişliği varyasyonlarından başka birçok özellik kullanılır. Ahşap anatomik çalışmaların dendroekolojik araştırmalara devam eden entegrasyonu sayesinde, dendroekoloji araştırmaları son on yılda gelişti ve geçmiş iklim koşullarının yeniden yapılandırılmasında her zamankinden daha fazla bir bel kemiği haline geldi 5,6,7,8.
Son on yılda, özellikle ahşap anatomisinde numune hazırlama ve analiz ile ilgili teknik gelişme güçlü olmasına rağmen 9,10,11,12,13,14, numune alma tekniklerinin basitleştirilmesine ilişkin neredeyse gerçek bir ilerleme kaydedilmemiştir15. Örneğin, akustik dalga teknolojisine16 rağmen, günümüze kadar ağaçlardan halkaların özelliklerini çıkarmak için güvenilir bir “tahribatsız” yöntem yoktur.
Sonuç olarak, ağaç halkası ile ilgili tüm çalışmalar hala ilgilenilen yerlerde alınan ağaçlardan veya çalılardan alınan ahşap örneklerine dayanmaktadır. Ağaçlara odaklanırken, standart prosedür gövdelerden15 artımlı çekirdekler almaktır.
Artımlı karotlar kullanarak çekirdek almak sıklıkla “tahribatsız” bir teknik olarak ifade edilir17. Diskleri gövdelerden almakla karşılaştırıldığında, bu doğrudur; Bununla birlikte, bu örnekleme tekniği, gövdede yaklaşık 1 cm çapında, çoğunlukla gövdenin3 özünün ötesine uzanan bir deliğe neden olur. Ağaç bu yarayı kendi başına kapatabilir, ancak bu süreç büyüme reaksiyonlarına neden olur, yaranın yakın çevresindeki ortak yapıyı değiştirir ve mantar hastalıkları nedeniyle deliğin etrafındaki mevcut ahşabın az ya da çok yoğun bir şekilde renk değiştirmesine neden olur18,19. Bu nedenle, “tahribatsız” yerine “minimal invaziv” olarak adlandırılmalıdır.
Artımlı karot alma tekniği, son zamanlarda mekanik matkapların kullanılabilmesi sayesinde gelişti ve özellikle ahşap anatomik analizler için daha kaliteli numuneler elde edilmesini sağladı15. Bu prosedür aynı zamanda manuel karot almaya kıyasla sahada çok zaman kazandırır. Değişmeden kalan, ağaçtan ekstraksiyondan etiketlemeye, nakliye için depolamaya ve çeşitli olası analiz teknikleri için laboratuvarda hazırlamaya kadar çekirdeklerin işlenmesi prosedürüydü.
Maçaların, nakliye sırasında kırılmalarını önlemek için plastik veya kağıttan yapılmış pipetler gibi sağlam kaplarda paketlenmesi gerekir. Çekirdeklerin etiketlenmesi, yumuşak kalemler kullanılarak doğrudan çekirdek üzerinde veya (daha sık) her bir pipetin dışında yapılır. Plastik kaplar kullanılırken, mantarların yayılmasını önlemek için çekirdekler kısa bir süre sonra çıkarılmalıdır. Bu nedenle, çekirdeklerin tekrar kaplardan çıkarılması gerekir. Çekirdekleri stabilize etmek ve kurumaya başladıklarında bükülmelerini önlemek için çekirdeklerin bir montaj parçasına sabitlenmesi gerekir. Bu aynı zamanda daha sonraki analizler için sonraki yüzey hazırlığına da yardımcı olur. Bunu yaparken, etiketlerin de ilgili bağlantılara aktarılması gerekir. Standart bir prosedür, çekirdekleri ahşap montajlara yapıştırmak veya oluklu mukavvaların kıvrımlarına bantla sabitlemektir. Bunları ahşap montajlara yapıştırmak en sık kullanılan tekniktir. Bu prosedür, çekirdekleri stabilize etmek, zımparalamak veya kesmek için mükemmel olsa da, potansiyel kimyasal, izotopik ve hatta ahşap anatomik analizleriyle ilgili çeşitli dezavantajları vardır. Diğer bir dezavantaj, gereken zamana rağmen, her bir çekirdek için etiketlerin yeni montajlara hataya açık bir şekilde aktarılmasıdır.
Dendrokronolojide, doğru tarihleme için bir temel olarak halka genişliği ölçümleri, tüm dendroekolojik çalışmaların bel kemiğidir20. Her ne kadar birçok laboratuvar hala ölçüm tabloları kullanan manuel ölçümlere güvense de, örneğin bağlı dürbünlerle Lintab21, çekirdek yüzeylerini dijitalleştirmek ve CooRecorder22 veya WinDENDRO23 gibi yazılımları kullanarak halka genişliğini ölçmek için düz yataklı tarayıcılar kullanma eğilimi vardır. Ne yazık ki, bu tarayıcılar, örneğin yaygın olarak kullanılan Epson Expression 10000XL, yapıları erken odun veya geç odun tracheidleri olarak açıkça göstermek için yeterli çözünürlüğe sahip değildir (Şekil 1). Bu nedenle, ortaya çıkan görüntüler, dürbün24,25 kullanarak orijinal çekirdeklere geri dönmeden doğru bir çapraz tarihleme prosedürü için kritik olan çok dar halkalar veya yoğunluk dalgalanmaları gibi zor yapıları tanımak için uygun değildir.
Ağaç halkası biliminde10 yüksek görüntü çözünürlüğü yeterli görüntü analizleri için vazgeçilmez bir ön koşul olduğundan, WSL’de (Skippy; https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) çekirdek yüzeylerdeki ağaç halkalarını bir dijital kamera kullanarak sayısallaştırmak için yeni bir görüntü yakalama sistemi geliştirilmiştir ve bu da mevcut tüm düz yataklı tarayıcılardan daha yüksek bir çözünürlük sunan görüntülerle sonuçlanmıştır. Bu sistem, 2007 yılında geliştirilen ATRICS-system26 fikrine dayanıyordu. Son zamanlarda, Skippy ile karşılaştırılabilir basit ama verimli bir görüntü yakalama sistemi, kendi kendine montaj kiti27 olarak sunuldu.
Ağaç halkalarının sayısallaştırılması, yani yansıyan ışık görüntüsünün yakalanması, zaman açısından verimli, dijital tabanlı bir halka genişliği ölçümünü desteklemek için artımlı çekirdeklerin veya disklerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini oluşturmada önemli bir adımdır. WSL’de geliştirilen sistem, iletilen ışığı kullanarak uzun mikro kesitlerden (40 cm’ye kadar) görüntü alınmasına da olanak sağlıyor. Bu ek özellik, örneğin, mikro kesitlerde reaksiyon ahşabının başlangıcını tanımlamak için dendrojeomorfik uygulamalar için ilgi çekicidir.
Çalışmada, sahada ve laboratuvarda karotları işleme sürecini kolaylaştırmak için bir protokol sunuyoruz. Sunulan yeni tekniğin tabanı yeniden kullanılabilir bir montajdır; 3D modelleme yazılımı kullanılarak tasarlanan ve bir 3D yazıcı ile basılan yeni GSC tutucu GärtnerSchneiderCore (GSC) tutucusu. GSC tutucu, sahada alınan karotların yeniden paketlenmeden veya yeniden etiketlenmeden doğrudan işlenmesine olanak tanır. Ayrıca, çekirdeklerin hazırlanan yüzeylerini sayısallaştırmak için verimli yeni bir sistem sunuyoruz. Bu protokol, sahadaki karotların alınmasından numune hazırlamaya, sonraki analizler için karot yüzeylerinin sayısallaştırılmasına ve nihayetinde bir arşivde saklanmasına kadar tüm prosedürü kapsar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Odun anatomisinin dendroekolojik çalışmalara dahil edilmesi, bu çalışmaları geçmiş çevresel koşulların yeni ve derinlemesine analizleri için geniş çapta açmıştır 28,29,30. Bu yeni teknikler aynı zamanda analitik çabaları, yani ilgilenilen verileri oluşturmak için gereken laboratuvar süresini de yoğunlaştırdı. Ahşap anatomik tekniklerle ilgili laboratuvar çalışmalarını optimize etmek ve laboratuvarda ihtiyaç duyulan süreyi azaltmak için çok sayıda girişimde bulunulmuştur 9,12,13,15,30. Ancak, bu çalışmalar için alınan çekirdeklerin taşınması, hazırlanması ve depolanması ile ilgili yaygın prosedürü kolaylaştırmak için neredeyse hiçbir çaba gösterilmemiştir.
3D baskı bu konuda yeni olanaklar sunuyor9. Yeni, 3D baskılı çekirdek tutucu, tüm bu prosedürü basitleştirmeye yönelik ilk girişimdir, bu da onu daha az zaman alıcı ve bunun için daha verimli hale getirir.
Çekirdeğin dışında (ve yakında içinde) mantarların gelişmesini önlemek için plastik pipetlerde31,32 veya benzer kaplarda saklanan çekirdeklerin çıkarılması gerekirken, GSC tutuculara sabitlenen çekirdekler olduğu gibi kalabilir. Bu noktaya kadar, onları kağıt pipetlerdesaklamakla karşılaştırılabilir 33.
Avantaj, (i) damarların samandan (veya başka bir kaptan) çıkarılması, (ii) bunların ahşap montajlara yapıştırılması veya kablo desteği olarak başka nesnelere sabitlenmesi ve (iii) onlarca yıldır neredeyse bir standart olduğu için her bir çekirdek için kullanılan ilgili kodun aktarılmasına yönelik muhtemelen hataya açık sürecin tamamı gerçekleşirgerçekleşmez ortaya çıkar çıkmaz 34, gereksiz hale gelir.
GSC tutucunun açık yapısı, plastik bir kapta saklandığında olduğu gibi, çekirdeklerin mantar istilası riski olmadan saklanmasına izin verir. Yukarıda açıklandığı gibi, tutucu ayrıca yapıyı stabilize etmek için parafine gömülmesine de izin verir. Bununla birlikte, bu “basit” gömme, mikro çekirdekler35 için yapıldığı gibi, numuneyi bir Parafin bloğuna gömmek için kasetler kullanan yaygın gömme prosedürleriyle karşılaştırılamaz. Basit teknik, mikro bölümleri keserken mısır nişastası uygulamakla oldukça karşılaştırılabilir36. Hücreleri daha iyi stabilize edecek ve kesme işlemi sırasında kırılmalarını önleyecektir, ancak sadece mısır nişastası eklemekten daha fazla zaman alıcıdır. Bu gömme biçimi, tüm çekirdeği bir bloğa gömülmüş gibi stabilize etmeyecektir. Çekirdek kırılırsa, bölümler de kırılır. GSC tutucu çekirdek mikrotom37’ye uyduğundan, yüzeyin sonraki sayısallaştırma işlemi için hazırlanması sadece birkaç dakika sürer.
Ağaç halkalarının sayısallaştırılması süreci için, mavi yoğunluk ölçümleri38,39 için sıklıkla kullanılan düz yataklı tarayıcıların uygulanması, elde edilen görüntülerin oldukça düşük kalitesi nedeniyle halka yapısının daha ayrıntılı görünümleri açısından tatmin edici değildi. Bu görüntülerde kozalaklı ağaçların ortak (geniş) halkalarının sınırları görülebilse de, dar halkaların ve hatta yoğunluk dalgalanmalarının tanımlanması neredeyse imkansızdı.
Ağaç halkalarını x-ray CT40 gibi yüksek çözünürlükte dijitalleştirmek için büyüleyici yeni girişimler olsa da, yüksek çözünürlüklü dijital kameralar kullanmak, daha fazla ölçüm için yüksek kaliteli görüntüler üretmenin en verimli ve uygun maliyetli yoludur.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, yeni tutucuyu yaratma fikrini desteklediği için Prof. Jussi Grießinger’e teşekkür etmek istiyor.
Materials
| Core-microtome | WSL | https://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/ | Microtome to cut micro sections from increment cores |
| Epson Expression 10000XL | EPSON | https://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL—Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA | flatbed scanner |
| GSC holder | WSL | in-house | 3D printed mount to fix cores for transport, preparation, analyses, and storage |
| Skippy image capturing system | WSL | https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) | Image capturing system developed at WSL equiped with a 61 MP camera (Sony Alpha 7R IV and Sony FE 90mm f/2.8 Macro lens) |
References
- Wimmer, R. Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudent and the early history of tree-ring crossdating. Dendrochronologia. 19 (1), 153-158 (2001).
- McGraw, D. J. Andrew Ellicott Douglass and the giant sequoias in the founding of dendrochronology. Tree-Ring Res. 59 (1), 21-27 (2003).
- Schweingruber, F. H. . Tree Rings and Environment: Dendroecology. , (1996).
- Amoroso, M. M., Daniels, L. D., Baker, P. J., Camarero, J. J. . Dendroecology: Tree-Ring Analyses Applied to Ecological Studies (Vol.231). 231, (2017).
- Lopez-Saez, J., Corona, C., Von Arx, G., Fonti, P., Slamova, L., Stoffel, M. Tree-ring anatomy of Pinus cembra trees opens new avenues for climate reconstructions in the European Alps. Sci Total Environ. 855, 158605 (2023).
- Björklund, J., et al. Fennoscandian tree-ring anatomy shows a warmer modern than medieval climate. Nature. 620 (7972), 97-103 (2023).
- Camarero, J. J., Colangelo, M., Rodriguez-Gonzalez, P. M. Tree growth, wood anatomy and carbon and oxygen isotopes responses to drought in Mediterranean riparian forests. Forest Ecol Manag. 529, 120710 (2023).
- Huang, R., Xu, C., Grießinger, J., Feng, X., Zhu, H., Bräuning, A. Rising utilization of stable isotopes in tree rings for climate change and forest ecology. JForestry Res. 35, 13 (2024).
- Schneider, L., Gärtner, H. Additive manufacturing for lab applications in environmental sciences: pushing the boundaries of rapid prototyping. Dendrochronologia. 76, 126015 (2022).
- Björklund, J., et al. Scientific merits and analytical challenges of tree-ring densitometry. Rev Geophys. 57, 1224-1264 (2019).
- Katzenmaier, M., Garnot, V. S. F., Björklund, J., Schneider, L., Wegner, J. D., von Arx, G. Towards ROXAS AI: Deep learning for faster and more accurate conifer cell analysis. Dendrochronologia. 81, 126126 (2023).
- Gärtner, H., Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. A new sledge microtome to combine wood anatomy and tree-ring ecology. IAWA J. 36 (4), 452-459 (2015).
- Gärtner, H., et al. A technical perspective in modern tree-ring research – how to overcome dendroecological and wood anatomical challenges. J Vis Exp. 97 (e52337), (2015).
- Gärtner, H., Banzer, L., Schneider, L., Schweingruber, F. H., Bast, A. Preparing micro sections of entire (dry) conifer increment cores for wood anatomical time-series analyses. Dendrochronologia. 34, 19-23 (2015).
- Gärtner, H., Schneider, L., Lucchinetti, S., Cherubini, P. Advanced workflow for taking high-quality increment cores – new techniques and devices. J Vis Exp. (193), e64747 (2023).
- Wang, X. Acoustic measurements on trees and logs: a review and analysis. Wood Sci Technol. 47, 965-975 (2013).
- Steenkamp, C. J., Van Rooyen, M. W., Van Rooyen, N. A non-destructive sampling method for dendrochronology in hardwood species. South Afr For J. 186, 5-7 (1999).
- Toole, E. R., Gammage, J. L. Damage from increment borings in bottomland hardwoods. J For. 57, 909-911 (1959).
- Grissino-Mayer, H. D. A manual and tutorial for the proper use of an increment borer. Tree-Ring Res. 59 (2), 63-79 (2003).
- Griffin, D., et al. Gigapixel macro photography of tree rings. Tree-Ring Res. 77, 86-94 (2021).
- . LINTAB-Precision ring by ring Available from: https://rinntech.info/products/lintab/ (2003)
- . Regent Instruments Available from: https://regentinstruments.com (2024)
- De Micco, V., et al. Intra-annual density fluctuations in tree rings: How, when, where, and why. IAWA J. 37, 232-259 (2016).
- Edwards, J., et al. Intra-annual climate anomalies in northwestern North America following the 1783-1784 CE Laki eruption. J Geophys Res Atmos. 126, e2020JD033544 (2020).
- Levanič, T. ATRICS-A new system for image acquisition in dendrochronology. Tree-Ring Res. 63 (2), 117-122 (2007).
- García-Hidalgo, M., et al. CaptuRING: A do-it-yourself tool for wood sample digitization. Methods Ecol Evol. 13 (6), 1185-1191 (2022).
- Rodriguez, D. R. O., et al. Exploring wood anatomy, density and chemistry profiles to understand the tree-ring formation in Amazonian tree species. Dendrochronologia. 71, 125915 (2022).
- Gärtner, H., Farahat, E. Cambial activity of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori in arid environments. Front Plant Sci. 12, 760002 (2021).
- Gärtner, H., Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. New perspectives for wood anatomical analysis in dendrosciences: the GSL1-microtome. Dendrochronologia. 32, 47-51 (2014).
- Maeglin, R. R. . Increment Cores: How to Collect, Handle, and Use Them (Vol. 25). , (1979).
- Agee, J. K., Huff, M. H. . The Care and Feeding of Increment Borers. , (1986).
- Phipps, R. L., , . . Collecting, Preparing, Crossdating, and Measuring Tree Increment Cores (No. 85-4148). , (1985).
- Cole, D. M. . Protection and Storing Increment Cores in Plastic Straws. 216, (1977).
- Rossi, S., Anfodillo, T., Menardi, R. Trephor: a new tool for sampling microcores from tree stems. IAWA J. 27 (1), 89-97 (2006).
- Schneider, L., Gärtner, H. The advantage of using a starch based non-Newtonian fluid to prepare micro sections. Dendrochronologia. 31, 175-178 (2013).
- Gärtner, H., Nievergelt, D. The core-microtome: A new tool for surface preparation on corse and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
- McCarroll, D., Pettigrew, E., Luckman, A., Guibal, F., Edouard, J. L. Blue reflectance provides a surrogate for latewood density of high-latitude pine tree rings. Arct Antarct Alp Res. 34 (4), 450-453 (2002).
- Björklund, J., Seftigen, K., Kaczka, R. J., Rydval, M., Wilson, R. A standard definition and terminology for Blue Intensity from conifers. Dendrochronologia. 85, 126200 (2024).
- Van den Bulcke, J., et al. Advanced X-ray CT scanning can boost tree ring research for earth system sciences. Ann Bot. 124 (5), 837-847 (2019).
.