Um novo fluxo de trabalho para amostragem e digitalização de núcleos de incremento
Summary
Apresentamos um protocolo para usar montagens impressas em 3D para fixar núcleos de incremento no campo sem a necessidade de desembalá-los e colá-los em montagens de madeira. O novo suporte GSC permite colocar os núcleos em um micrótomo central para cortar sua superfície e transferi-los diretamente para a captura digital de imagens.
Abstract
Aqui, apresentamos um novo fluxo de trabalho, desde a coleta de núcleos de incremento no campo, armazenando-os e transportando-os para o laboratório, até a digitalização de seus anéis de árvores para análises dendroecológicas posteriores. O procedimento envolve o uso de novos portadores de amostra para núcleos de incremento. Esses novos suportes Gärtner Schneider Core (GSC) são projetados usando software de modelagem tridimensional (3D) e, finalmente, impressos com uma impressora 3D. Usando essas montagens desde o início no campo, os núcleos podem ser cortados diretamente com um micrótomo central e sua superfície pode ser digitalizada sem rearranjo adicional usando um novo sistema de captura de imagem de alta resolução. Eles estão, portanto, disponíveis para análise direta. Este sistema permite digitalizar anéis de árvores a partir de núcleos e discos, e também tirar imagens de micro seções longas (até 40 cm) usando luz transmitida. Esta característica é de especial interesse para aplicações dendroecológicas e geomórficas para identificar o início de qualquer perturbação em micro seções cortadas com um micrótomo central.
Introduction
O princípio da datação dos anéis das árvores aplicando a técnica de datação cruzada foi introduzido pela primeira vez pelo cientista florestal austríaco Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudent em 18811. Na primeira metade doséculo 20, essa técnica foi reinventada pelo “Pai da Dendrocronologia” Andrew Ellicott Douglass, que a aplicou intensamente na datação de sítios arqueológicos e árvores vivas2.
Atualmente, a dendroecologia, o tópico de pesquisa que atua como uma espécie de quadro ambiental da dendrocronologia, é definida como o estudo dos anéis de crescimento e suas variações de crescimento inerentes causadas por mudanças ecológicas e ambientais no tempo3. Na pesquisa dendroecológica, muitas outras características além das variações da largura do anel, como isótopos estáveis, densidade tardia da madeira ou características celulares dentro de anéis únicos, são usadas para correlacionar esses dados a parâmetros ambientais para entender melhor o impacto das condições ambientais no crescimento das árvores ao longo do tempo4. Por meio da integração contínua dos estudos anatômicos da madeira à pesquisa dendroecológica, a pesquisa dendroecológica evoluiu na última década e é mais do que nunca uma espinha dorsal na reconstrução das condições climáticas passadas 5,6,7,8.
Embora o desenvolvimento técnico em relação ao preparo e análise de amostras, especialmente em anatomia da madeira, tenha sido forte na última década 9,10,11,12,13,14, quase não houve avanço real em relação à simplificação das técnicas de amostragem 15. Apesar, por exemplo, da tecnologia de ondas acústicas16, até hoje não existe um método “não destrutivo” confiável para extrair as características dos anéis das árvores.
Consequentemente, todos os estudos relacionados aos anéis de árvores ainda dependem de amostras de madeira retiradas de árvores ou arbustos coletados nos locais de interesse. Ao focar em árvores, o procedimento padrão é tirar núcleos de incremento das hastes15.
A obtenção de testemunhos usando testemunhos de incremento é freqüentemente expressa como uma técnica “não destrutiva”17. Comparado a tirar discos de hastes, isso está correto; No entanto, essa técnica de amostragem causa um orifício no caule de cerca de 1 cm de diâmetro, atingindo principalmente além da medula do caule3. A árvore é capaz de fechar essa ferida sozinha, mas esse processo causa reações de crescimento, alterando a estrutura comum nas proximidades da ferida, bem como uma descoloração mais ou menos intensa da madeira existente ao redor do buraco por causa de doenças fúngicas18,19. Portanto, deve ser melhor chamado de “minimamente invasivo” em vez de “não destrutivo”.
A técnica de retirada de testemunhos de incremento evoluiu recentemente através da capacidade de uso de brocas mecânicas, resultando em amostras de maior qualidade, especialmente para análises anatômicas de madeira15. Este procedimento também economiza muito tempo no campo em comparação com a retirada do núcleo manual. O que permaneceu inalterado foi o procedimento de manuseio dos núcleos, desde a extração da árvore até a rotulagem, armazenamento para transporte e preparação em laboratório para várias técnicas de análise possíveis.
Os núcleos ainda precisam ser embalados em recipientes estáveis, como canudos feitos de plástico ou papel, para evitar que se quebrem durante o transporte. A rotulagem dos núcleos é feita diretamente no núcleo usando lápis macios ou (mais frequentemente) na parte externa de cada canudo. Ao usar recipientes de plástico, os núcleos devem ser retirados após um curto período de tempo para evitar a propagação de fungos. Portanto, os núcleos precisam ser retirados dos contêineres novamente. Para estabilizar os núcleos e evitar que dobrem quando começarem a secar, os núcleos precisam ser fixados em um suporte. Isso também ajuda na preparação subsequente da superfície para análises posteriores. Ao fazer isso, as etiquetas também precisam ser transferidas para as respectivas montagens. Um procedimento padrão é colar os núcleos em suportes de madeira ou fixá-los com fita adesiva nos riachos de papelão ondulado. Colá-los em suportes de madeira é a técnica mais usada. Embora este procedimento seja perfeito para estabilizar e lixar ou cortar os núcleos, ele tem várias desvantagens em relação a possíveis análises anatômicas químicas, isotópicas e até mesmo de madeira. Outra desvantagem, apesar do tempo necessário, é a transferência propensa a erros das etiquetas de cada núcleo para as novas montagens.
Em dendrocronologia, as medições da largura do anel como base para datações precisas são a espinha dorsal de todos os estudos dendroecológicos20. Embora muitos laboratórios ainda dependam de medições manuais usando tabelas de medição, por exemplo, Lintab21 com binóculos acoplados, há uma tendência de usar scanners de mesa para digitalizar superfícies de núcleo e medir a largura do anel usando software como CooRecorder22 ou WinDENDRO23. Infelizmente, esses scanners, por exemplo, o amplamente utilizado Epson Expression 10000XL, não têm resolução suficiente para descrever claramente as estruturas como traqueídeos de madeira inicial ou tardia (Figura 1). Por esse motivo, as imagens resultantes não são adequadas para reconhecer estruturas difíceis, como anéis muito estreitos ou flutuações de densidade, que são críticas para um procedimento preciso de datação cruzada sem voltar aos núcleos originais usando binóculos 24,25.
Uma vez que a alta resolução de imagem é um pré-requisito indispensável para análises de imagem adequadas na ciência dos anéis de árvores10, um novo sistema de captura de imagens foi desenvolvido no WSL (Skippy; https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) para digitalizar anéis de árvores nas superfícies do núcleo usando uma câmera digital, resultando em imagens apresentando uma resolução mais alta do que todos os scanners de mesa existentes. Este sistema foi baseado na ideia do sistema ATRICS26, desenvolvido em 2007. Mais recentemente, um sistema de captura de imagem simples, mas eficiente, comparável ao Skippy foi apresentado como um kit de automontagem27.
A digitalização de anéis de árvores, ou seja, a captura de imagens de luz refletida, é uma etapa importante na criação de imagens de alta resolução de núcleos ou discos de incremento para suportar uma medição de largura de anel com eficiência de tempo e baseada digitalmente. O sistema desenvolvido na WSL também permite tirar imagens de micro cortes longos (até 40 cm) usando luz transmitida. Essa característica adicional é, por exemplo, de interesse para aplicações dendrogeomórficas para identificar o início da madeira de reação em micro seções.
No estudo, apresentamos um protocolo para facilitar o processo de manuseio de testemunhos no campo e no laboratório. A base da nova técnica apresentada é uma montagem reutilizável; o novo suporteGSC G ärtnerSchneiderCore (GSC) projetado usando software de modelagem 3D e impresso com uma impressora 3D. O suporte GSC permite o manuseio direto dos núcleos retirados no campo sem reembalá-los ou rotulá-los novamente. Também apresentamos um novo sistema eficiente para digitalizar as superfícies preparadas dos machos. Este protocolo abrange todo o procedimento, desde a coleta de testemunhos em campo até a preparação de amostras, digitalização das superfícies de testemunhos para análises subsequentes e, eventualmente, armazenamento em um arquivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A inclusão da anatomia da madeira nos estudos dendroecológicos abriu amplamente esses estudos para novas e aprofundadas análises das condições ambientais passadas 28,29,30. Essas novas técnicas também intensificaram os esforços analíticos, ou seja, o tempo de laboratório necessário para gerar os dados de interesse. Houve inúmeras tentativas de otimizar o trabalho de laboratório e reduzir o tempo necessário no laboratório em relação às técnicas anatômicas da madeira 9,12,13,15,30. Mas quase nenhum esforço foi feito para facilitar o procedimento comum de manuseio, preparação e armazenamento de testemunhos para esses estudos.
A impressão 3D oferece novas possibilidades a esse respeito9. O novo suporte de núcleo impresso em 3D é a primeira tentativa de simplificar todo esse procedimento, tornando-o menos demorado e, para isso, mais eficiente.
Enquanto os núcleos armazenados em palhinhas de plástico31,32 ou recipientes comparáveis têm de ser retirados para evitar que os fungos se desenvolvam no exterior (e em breve também no interior) do núcleo, os núcleos fixados nos suportes GSC podem permanecer como estão. Até este ponto, é comparável a armazená-los em canudos de papel33.
A vantagem torna-se clara assim que todo o procedimento de (i) remover os núcleos da palha (ou outro recipiente), (ii) colá-los em suportes de madeira ou fixá-los em outros objetos como suportes de cabos, e (iii) o processo possivelmente propenso a erros de transferência do respectivo código usado para cada núcleo, pois era quase um padrão há décadas34, torna-se desnecessário.
A estrutura aberta do suporte GSC permite armazenar os núcleos sem o risco de infestação fúngica, como seria o caso quando armazenado em um recipiente de plástico. Conforme descrito acima, o suporte também permite uma incorporação em parafina para estabilizar a estrutura. No entanto, essa incorporação “simples” não pode ser comparada aos procedimentos comuns de incorporação usando para incorporar a amostra em um bloco de parafina, como é feito para micro núcleos35. A técnica simples é bastante comparável à aplicação de amido de milho no corte de micro seções36. Isso estabilizará melhor as células e evitará que elas se quebrem durante o procedimento de corte, mas é mais demorado do que simplesmente adicionar amido de milho. Essa forma de incorporação não estabilizará todo o núcleo como se estivesse embutido em um bloco. Se o núcleo estiver quebrado, as seções também quebrarão. Como o suporte GSC se encaixa no micrótomo do núcleo37, a preparação da superfície para o processo de digitalização subsequente leva apenas alguns minutos.
Para o processo de digitalização de anéis de árvores, a aplicação de scanners de mesa, freqüentemente usados para medições de intensidade de azul38,39, não foi satisfatória em relação a visualizações mais detalhadas da estrutura do anel devido à qualidade bastante baixa das imagens resultantes. Embora os limites dos anéis comuns (largos) de coníferas fossem visíveis nessas imagens, anéis estreitos, ou mesmo flutuações de densidade, eram quase impossíveis de identificar.
Embora existam novas tentativas fascinantes de digitalizar anéis de árvores em alta resolução, como o raio-x CT40, o uso de câmeras digitais com alta resolução ainda é a maneira mais eficiente e econômica de produzir imagens de alta qualidade para medições posteriores.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Prof. Jussi Grießinger por apoiar a ideia de criar o novo titular.
Materials
| Core-microtome | WSL | https://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/ | Microtome to cut micro sections from increment cores |
| Epson Expression 10000XL | EPSON | https://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL—Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA | flatbed scanner |
| GSC holder | WSL | in-house | 3D printed mount to fix cores for transport, preparation, analyses, and storage |
| Skippy image capturing system | WSL | https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) | Image capturing system developed at WSL equiped with a 61 MP camera (Sony Alpha 7R IV and Sony FE 90mm f/2.8 Macro lens) |
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