זרימת עבודה חדשה לדגימה ודיגיטציה של ליבות הפרש קבוע
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לשימוש בתושבות המודפסות בתלת-ממד כדי לתקן ליבות תוספות בשטח ללא צורך לפרוק ולהדביק אותן על תושבות עץ. מחזיק ה-GSC החדש מאפשר למקם את הליבות במיקרוטום ליבה כדי לחתוך את פני השטח שלהן ולהעביר אותן ישירות ללכידת תמונה דיגיטלית.
Abstract
כאן אנו מציגים זרימת עבודה חדשה מלקיחת ליבות תוספות בשטח, אחסונן והובלתן למעבדה, לדיגיטציה של טבעות העצים שלהן לצורך ניתוחים נוספים לניתוחים דנדרואקולוגיים עוקבים. ההליך כולל שימוש בנשאים מדגם חדשים עבור ליבות תוספת. מחזיקי Gärtner Schneider Core (GSC) החדשים הללו מתוכננים באמצעות תוכנת מידול תלת-ממדית (3D) ולבסוף מודפסים במדפסת תלת-ממד. באמצעות תושבות אלה מההתחלה בשטח, ניתן לחתוך את הליבות ישירות באמצעות מיקרוטום ליבה, ולאחר מכן ניתן להפוך את פני השטח שלהן לדיגיטליים ללא סידור מחדש נוסף באמצעות מערכת לכידת תמונות חדשה ברזולוציה גבוהה. לכן הם זמינים לניתוח ישיר. מערכת זו מאפשרת דיגיטציה של טבעות עצים מליבות ודיסקים, וכן צילום תמונות מקטעים זעירים ארוכים (עד 40 ס”מ) באמצעות אור משודר. תכונה זו היא בעלת עניין מיוחד עבור יישומים דנדרואקולוגיים וגיאומורפיים כדי לזהות את תחילתה של כל הפרעה במקטעים מיקרו חתוכים עם מיקרוטום הליבה.
Introduction
העיקרון של תיארוך טבעות עצים על ידי יישום טכניקת התיארוך המשולב הוצג לראשונה על ידי מדען היערות האוסטרי ארתור פרייהר פון זקנדורף-גודנט בשנת 18811. במחצית הראשונה של המאהה-20 , טכניקה זו הומצאה מחדש על ידי “אבי הדנדרוכרונולוגיה” אנדרו אליקוט דאגלס, שיישם אותה באופן אינטנסיבי בתיארוך אתרים ארכיאולוגיים ועצים חיים2.
כיום, דנדרואקולוגיה, נושא המחקר הפועל כמעין מסגרת סביבתית של דנדרוכרונולוגיה, מוגדרת כחקר טבעות עצים ושינויי הצמיחה הטבועים בהן הנגרמות על ידי שינויים אקולוגיים וסביבתיים בזמן3. במחקר דנדרואקולוגי, מאפיינים רבים אחרים מלבד שינויים ברוחב הטבעת, כגון איזוטופים יציבים, צפיפות עץ מאוחרת או מאפייני תאים בתוך טבעות בודדות, משמשים כדי להתאים נתונים אלה לפרמטרים סביבתיים כדי להבין טוב יותר את ההשפעה של תנאי הסביבה על צמיחת עצים לאורך זמן4. באמצעות השילוב המתמשך של מחקרים אנטומיים של עץ למחקר דנדרואקולוגי, המחקר הדנדרואקולוגי התפתח בעשור האחרון והוא יותר מתמיד עמוד השדרה בשחזור תנאי אקלים קודמים 5,6,7,8.
למרות שההתפתחות הטכנית בכל הנוגע להכנת הדגימות וניתוחן, במיוחד באנטומיה של עץ, הייתה חזקה בעשור האחרון 9,10,11,12,13,14, כמעט ולא הייתה התקדמות של ממש לגבי פישוט טכניקות הדגימה 15. למרות, למשל, טכנולוגיית גלים אקוסטיים16, עד היום אין שיטה “לא הרסנית” אמינה לחילוץ תכונות הטבעות מעצים.
כתוצאה מכך, כל המחקרים הקשורים לטבעות עצים עדיין מסתמכים על דגימות עץ שנלקחו מעצים או שיחים שנלקחו באתרים המעניינים. כאשר מתמקדים בעצים, ההליך הסטנדרטי הוא לקיחת ליבות תוספות מגבעולים15.
לקיחת ליבות באמצעות ליבות מצטברות מתבטאת לעתים קרובות כטכניקה “לא הרסנית”17. בהשוואה ללקיחת דיסקים מגבעולים, זה נכון; עם זאת, טכניקת דגימה זו גורמת לחור בגבעול בקוטר של כ-1 ס”מ, המגיע ברובו מעבר לפיתה של הגבעול3. העץ מסוגל לסגור פצע זה בכוחות עצמו, אך תהליך זה גורם לתגובות צמיחה, שינוי המבנה הנפוץ בסביבה הקרובה של הפצע וכן שינוי צבע אינטנסיבי פחות או יותר של העץ הקיים סביב החור בגלל מחלות פטרייתיות18,19. לכן, עדיף לקרוא לזה “זעיר פולשני” ולא “לא הרסני”.
הטכניקה של לקיחת ליבות תוספות התפתחה לאחרונה באמצעות היכולת להשתמש במקדחות מכניות, וכתוצאה מכך דגימות באיכות גבוהה יותר, במיוחד עבור אנליזות אנטומיות עץ15. הליך זה גם חוסך זמן רב בשטח בהשוואה לגימור ידני. מה שנותר ללא שינוי היה הליך הטיפול בליבות, החל מהחילוץ מהעץ ועד לתיוג, אחסון להובלה והכנתם במעבדה לטכניקות ניתוח אפשריות שונות.
ליבות עדיין צריך להיות ארוז במיכלים יציבים, כגון קשיות עשויות פלסטיק או נייר, כדי למנוע מהם להישבר במהלך ההובלה. תיוג הליבות נעשה ישירות על הליבה באמצעות עפרונות רכים או (בתדירות גבוהה יותר) בחלק החיצוני של כל קשית. בעת שימוש במיכלי פלסטיק, יש להוציא את הליבות לאחר זמן קצר כדי למנוע התפשטות פטריות. אז, את הליבות צריך להוציא מתוך המיכלים שוב. כדי לייצב את הליבות ולמנוע מהן להתכופף כאשר הן מתחילות להתייבש, יש לקבע את הליבות על תושבת. זה גם עוזר עם הכנת פני השטח הבאים לניתוחים נוספים. כאשר עושים זאת, יש להעביר את התוויות גם לתושבות המתאימות. הליך סטנדרטי הוא הדבקת הליבות על תושבות עץ או קיבוע אותם עם סרט ב rills של לוחות גלי. הדבקתם על תושבות עץ היא הטכניקה הנפוצה ביותר. למרות שהליך זה מושלם לייצוב ושיוף או חיתוך הליבות, יש לו מספר חסרונות לגבי ניתוחים אנטומיים פוטנציאליים, איזוטופיים ואפילו עץ. חסרון נוסף, למרות הזמן הנדרש, הוא העברה מועדת לשגיאות של התוויות עבור כל ליבה לתושבות החדשות.
בדנדרוכרונולוגיה, מדידות רוחב טבעת כבסיס לתיארוך מדויק הן עמוד השדרה של כל המחקרים הדנדרואקולוגיים20. למרות שמעבדות רבות עדיין מסתמכות על מדידות ידניות באמצעות טבלאות מדידה, למשל, Lintab21 עם משקפת מחוברת, קיימת מגמה של שימוש בסורקים שטוחים כדי להפוך משטחי ליבה לדיגיטליים ולמדוד רוחב טבעת באמצעות תוכנות כגון CooRecorder22 או WinDENDRO23. למרבה הצער, לסורקים אלה, למשל Epson Expression 10000XL הנמצאים בשימוש נרחב, אין רזולוציה מספקת כדי לתאר בבירור מבנים כטרכאידים מעץ מוקדם או מעץ מאוחר (איור 1). מסיבה זו, התמונות המתקבלות אינן מתאימות לזיהוי מבנים קשים כגון טבעות צרות מאוד או תנודות צפיפות, שהן קריטיות להליך הצלבה מדויק מבלי לחזור לליבות המקוריות באמצעות משקפת24,25.
מכיוון שרזולוציית תמונה גבוהה היא תנאי הכרחי לניתוח תמונה הולם במדע טבעות עצים10, פותחה מערכת חדשה ללכידת תמונות ב- WSL (Skippy; https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) כדי להפוך טבעות עצים על משטחי ליבה לדיגיטליות באמצעות מצלמה דיגיטלית וכתוצאה מכך תמונות מציגות רזולוציה גבוהה יותר מכל הסורקים השטוחים הקיימים. מערכת זו התבססה על הרעיון של מערכת ATRICS26, שפותחה בשנת 2007. לאחרונה, מערכת לכידת תמונות פשוטה אך יעילה הדומה ל- Skippy הוצגה כערכת הרכבה עצמית27.
דיגיטציה של טבעות עצים, כלומר לכידת תמונות אור מוחזרות, היא צעד חשוב ביצירת תמונות ברזולוציה גבוהה של ליבות או דיסקים במרווחים כדי לתמוך במדידת רוחב טבעת דיגיטלית חסכונית בזמן. המערכת שפותחה ב-WSL מאפשרת גם לצלם תמונות ממקטעים מיקרו ארוכים (עד 40 ס”מ) באמצעות אור משודר. תכונה נוספת זו מעניינת, למשל, יישומים דנדרוגאומורפיים לזיהוי תחילתו של עץ תגובה במקטעים מיקרו.
במחקר אנו מציגים פרוטוקול המקל על תהליך הטיפול בליבות בשטח ובמעבדה. הבסיס של הטכניקה החדשה שהוצגה הוא תושבת לשימוש חוזר; מחזיק ה-GSC החדש GärtnerSchneiderCore (GSC) תוכנן באמצעות תוכנת מידול תלת-ממד והודפס במדפסת תלת-ממד. מחזיק GSC מאפשר טיפול פשוט של הליבות שנלקחו בשטח מבלי לארוז מחדש או לתייג אותן מחדש. כמו כן, אנו מציגים מערכת חדשה ויעילה לדיגיטציה של המשטחים המוכנים של הליבות. פרוטוקול זה מקיף את כל ההליך החל מלקיחת ליבות בשטח ועד להכנת דגימות, דיגיטציה של משטחי הליבה לניתוחים הבאים, ובסופו של דבר אחסונם בארכיון.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכללת אנטומיה של עץ במחקרים דנדרואקולוגיים פתחה מחקרים אלה באופן נרחב לניתוחים חדשים ומעמיקים של תנאי סביבה בעבר 28,29,30. טכניקות חדשות אלה גם הגבירו את המאמצים האנליטיים, כלומר זמן המעבדה הדרוש כדי להפיק את הנתונים המעניינים. נעשו ניסיונות רבים לייעל את עבודת המעבדה ולצמצם את הזמן הדרוש במעבדה בנוגע לטכניקות אנטומיות עץ 9,12,13,15,30. אך כמעט ולא נעשו מאמצים להקל על ההליך הנפוץ של טיפול, הכנה ואחסון של ליבות שנלקחו עבור מחקרים אלה.
הדפסה תלת מימדית מציעה אפשרויות חדשות בהקשר זה9. מחזיק הליבה החדש, המודפס בתלת-ממד, הוא הניסיון הראשון לפשט את כל התהליך הזה, מה שהופך אותו לפחות גוזל זמן ולשם כך יעיל יותר.
בעוד ליבות המאוחסנות בקשיות פלסטיק31,32 או במיכלים דומים צריכות להיות מוצאות החוצה כדי למנוע התפתחות פטריות בחלק החיצוני (ובקרוב גם הפנימי) של הליבה, ליבות קבועות במחזיקי GSC יכולות להישאר כפי שהן. עד כאן ניתן להשוות את אחסונם בקשיות נייר33.
היתרון מתברר ברגע שכל ההליך של (i) הסרת הליבות מהקש (או מיכל אחר), (ii) הדבקתן על תושבות עץ או קיבוע שלהן על אובייקטים אחרים כתומכי כבלים, ו-(iii) התהליך המועד לשגיאות של העברת הקוד המתאים המשמש לכל ליבה כפי שהיה כמעט תקן במשך עשרות שניםכבר 34, הופך להיות מיותר.
המבנה הפתוח של מחזיק GSC מאפשר לאחסן את הליבות ללא הסיכון של התפשטות פטרייתית, כפי שיהיה במקרה כאשר מאוחסן במיכל פלסטיק. כפי שתואר לעיל, המחזיק מאפשר גם הטבעה בפרפין כדי לייצב את המבנה. עם זאת, לא ניתן להשוות הטבעה “פשוטה” זו להליכי הטבעה נפוצים באמצעות קלטות להטמעת הדגימה בבלוק פרפין כפי שנעשה עבור ליבות מיקרו35. הטכניקה הפשוטה דומה למדי ליישום עמילן תירס בעת חיתוך מיקרו חלקים36. זה ייצב טוב יותר את התאים וימנע מהם להישבר במהלך הליך החיתוך, אבל זה לוקח יותר זמן מאשר פשוט להוסיף עמילן תירס. צורת הטבעה זו לא תייצב את כל הליבה כאילו הוטבעה בבלוק. אם הליבה שבורה, גם החלקים יישברו. מכיוון שמחזיק GSC מתאים לליבת מיקרוטום37, הכנת פני השטח לתהליך הדיגיטציה הבא אורכת מספר דקות בלבד.
עבור תהליך הדיגיטציה של טבעות עצים, היישום של סורקים שטוחים, המשמשים לעתים קרובות למדידות עוצמה כחולה38,39, לא היה משביע רצון לגבי תצוגות מפורטות יותר של מבנה הטבעת, בגלל האיכות הנמוכה למדי של התמונות שהתקבלו. למרות שגבולותיהן של טבעות מחטניות נפוצות (רחבות) נראו בתמונות אלה, טבעות צרות, או אפילו תנודות צפיפות, היו כמעט בלתי אפשריות לזיהוי.
למרות שישנם ניסיונות חדשים ומרתקים לדיגיטציה של טבעות עצים ברזולוציה גבוהה, כגון רנטגן CT40, שימוש במצלמות דיגיטליות ברזולוציה גבוהה הוא עדיין הדרך היעילה והחסכונית ביותר להפיק תמונות באיכות גבוהה למדידות נוספות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לפרופ’ יוסי גריזינגר על תמיכתו ברעיון יצירת המחזיק החדש.
Materials
| Core-microtome | WSL | https://www.wsl.ch/en/services-produkte/microtomes/ | Microtome to cut micro sections from increment cores |
| Epson Expression 10000XL | EPSON | https://epson.com/Support/Scanners/Expression-Series/Epson-Expression-10000XL—Graphic-Arts/s/SPT_E10000XL-GA | flatbed scanner |
| GSC holder | WSL | in-house | 3D printed mount to fix cores for transport, preparation, analyses, and storage |
| Skippy image capturing system | WSL | https://www.wsl.ch/en/services-produkte/skippy/) | Image capturing system developed at WSL equiped with a 61 MP camera (Sony Alpha 7R IV and Sony FE 90mm f/2.8 Macro lens) |
References
- Wimmer, R. Arthur Freiherr von Seckendorff-Gudent and the early history of tree-ring crossdating. Dendrochronologia. 19 (1), 153-158 (2001).
- McGraw, D. J. Andrew Ellicott Douglass and the giant sequoias in the founding of dendrochronology. Tree-Ring Res. 59 (1), 21-27 (2003).
- Schweingruber, F. H. . Tree Rings and Environment: Dendroecology. , (1996).
- Amoroso, M. M., Daniels, L. D., Baker, P. J., Camarero, J. J. . Dendroecology: Tree-Ring Analyses Applied to Ecological Studies (Vol.231). 231, (2017).
- Lopez-Saez, J., Corona, C., Von Arx, G., Fonti, P., Slamova, L., Stoffel, M. Tree-ring anatomy of Pinus cembra trees opens new avenues for climate reconstructions in the European Alps. Sci Total Environ. 855, 158605 (2023).
- Björklund, J., et al. Fennoscandian tree-ring anatomy shows a warmer modern than medieval climate. Nature. 620 (7972), 97-103 (2023).
- Camarero, J. J., Colangelo, M., Rodriguez-Gonzalez, P. M. Tree growth, wood anatomy and carbon and oxygen isotopes responses to drought in Mediterranean riparian forests. Forest Ecol Manag. 529, 120710 (2023).
- Huang, R., Xu, C., Grießinger, J., Feng, X., Zhu, H., Bräuning, A. Rising utilization of stable isotopes in tree rings for climate change and forest ecology. JForestry Res. 35, 13 (2024).
- Schneider, L., Gärtner, H. Additive manufacturing for lab applications in environmental sciences: pushing the boundaries of rapid prototyping. Dendrochronologia. 76, 126015 (2022).
- Björklund, J., et al. Scientific merits and analytical challenges of tree-ring densitometry. Rev Geophys. 57, 1224-1264 (2019).
- Katzenmaier, M., Garnot, V. S. F., Björklund, J., Schneider, L., Wegner, J. D., von Arx, G. Towards ROXAS AI: Deep learning for faster and more accurate conifer cell analysis. Dendrochronologia. 81, 126126 (2023).
- Gärtner, H., Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. A new sledge microtome to combine wood anatomy and tree-ring ecology. IAWA J. 36 (4), 452-459 (2015).
- Gärtner, H., et al. A technical perspective in modern tree-ring research – how to overcome dendroecological and wood anatomical challenges. J Vis Exp. 97 (e52337), (2015).
- Gärtner, H., Banzer, L., Schneider, L., Schweingruber, F. H., Bast, A. Preparing micro sections of entire (dry) conifer increment cores for wood anatomical time-series analyses. Dendrochronologia. 34, 19-23 (2015).
- Gärtner, H., Schneider, L., Lucchinetti, S., Cherubini, P. Advanced workflow for taking high-quality increment cores – new techniques and devices. J Vis Exp. (193), e64747 (2023).
- Wang, X. Acoustic measurements on trees and logs: a review and analysis. Wood Sci Technol. 47, 965-975 (2013).
- Steenkamp, C. J., Van Rooyen, M. W., Van Rooyen, N. A non-destructive sampling method for dendrochronology in hardwood species. South Afr For J. 186, 5-7 (1999).
- Toole, E. R., Gammage, J. L. Damage from increment borings in bottomland hardwoods. J For. 57, 909-911 (1959).
- Grissino-Mayer, H. D. A manual and tutorial for the proper use of an increment borer. Tree-Ring Res. 59 (2), 63-79 (2003).
- Griffin, D., et al. Gigapixel macro photography of tree rings. Tree-Ring Res. 77, 86-94 (2021).
- . LINTAB-Precision ring by ring Available from: https://rinntech.info/products/lintab/ (2003)
- . Regent Instruments Available from: https://regentinstruments.com (2024)
- De Micco, V., et al. Intra-annual density fluctuations in tree rings: How, when, where, and why. IAWA J. 37, 232-259 (2016).
- Edwards, J., et al. Intra-annual climate anomalies in northwestern North America following the 1783-1784 CE Laki eruption. J Geophys Res Atmos. 126, e2020JD033544 (2020).
- Levanič, T. ATRICS-A new system for image acquisition in dendrochronology. Tree-Ring Res. 63 (2), 117-122 (2007).
- García-Hidalgo, M., et al. CaptuRING: A do-it-yourself tool for wood sample digitization. Methods Ecol Evol. 13 (6), 1185-1191 (2022).
- Rodriguez, D. R. O., et al. Exploring wood anatomy, density and chemistry profiles to understand the tree-ring formation in Amazonian tree species. Dendrochronologia. 71, 125915 (2022).
- Gärtner, H., Farahat, E. Cambial activity of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori in arid environments. Front Plant Sci. 12, 760002 (2021).
- Gärtner, H., Lucchinetti, S., Schweingruber, F. H. New perspectives for wood anatomical analysis in dendrosciences: the GSL1-microtome. Dendrochronologia. 32, 47-51 (2014).
- Maeglin, R. R. . Increment Cores: How to Collect, Handle, and Use Them (Vol. 25). , (1979).
- Agee, J. K., Huff, M. H. . The Care and Feeding of Increment Borers. , (1986).
- Phipps, R. L., , . . Collecting, Preparing, Crossdating, and Measuring Tree Increment Cores (No. 85-4148). , (1985).
- Cole, D. M. . Protection and Storing Increment Cores in Plastic Straws. 216, (1977).
- Rossi, S., Anfodillo, T., Menardi, R. Trephor: a new tool for sampling microcores from tree stems. IAWA J. 27 (1), 89-97 (2006).
- Schneider, L., Gärtner, H. The advantage of using a starch based non-Newtonian fluid to prepare micro sections. Dendrochronologia. 31, 175-178 (2013).
- Gärtner, H., Nievergelt, D. The core-microtome: A new tool for surface preparation on corse and time series analysis of varying cell parameters. Dendrochronologia. 28 (2), 85-92 (2010).
- McCarroll, D., Pettigrew, E., Luckman, A., Guibal, F., Edouard, J. L. Blue reflectance provides a surrogate for latewood density of high-latitude pine tree rings. Arct Antarct Alp Res. 34 (4), 450-453 (2002).
- Björklund, J., Seftigen, K., Kaczka, R. J., Rydval, M., Wilson, R. A standard definition and terminology for Blue Intensity from conifers. Dendrochronologia. 85, 126200 (2024).
- Van den Bulcke, J., et al. Advanced X-ray CT scanning can boost tree ring research for earth system sciences. Ann Bot. 124 (5), 837-847 (2019).
.