Sağlam Drosophila Larvalarında Lazer Hücre Ablasyonu Sinaptik Rekabeti Ortaya Çıkardı
Summary
Bu protokol, sağlam Drosophila larvalarında bireysel nöronların lazer hücresi ablasyonunu gösterir. Yöntem, gelişmekte olan sinir sistemindeki nöronlar arasındaki rekabeti azaltmanın etkisinin incelenmesini sağlar.
Abstract
Protokol, sağlam Drosophila melanogaster larvalarının merkezi sinir sisteminde (CNS) 2-foton lazer sistemi ile tek nöron ablasyonunu tanımlar. Bu non-invaziv yöntem kullanılarak, gelişmekte olan sinir sistemi hücreye özgü bir şekilde manipüle edilebilir. Bir ağdaki bireysel nöronların gelişimini bozmak, sinir sisteminin sinaptik girdi kaybını nasıl telafi edebileceğini incelemek için kullanılabilir. Bireysel nöronlar, Drosophila’nın dev lif sisteminde, iki nörona odaklanarak spesifik olarak kesildi: presinaptik dev lif (GF) ve postsinaptik tergotrokanteral motor nöron (TTMn). GF, kaçış tepkisi için çok önemli olan ipsilateral TTMn ile sinaps yapar. 3. instar beyindeki GF’lerden birinin, GF aksonal büyümeye başladıktan hemen sonra kesilmesi, CNS’nin gelişimi sırasında hücreyi kalıcı olarak uzaklaştırır. Kalan GF, eksik komşuya reaksiyona girer ve kontralateral TTMn’ye ektopik bir sinaptik terminal oluşturur. Bu atipik, iki taraflı simetrik terminal, boya eşleşmesi ile gösterildiği gibi her iki TTMN’yi de innerve eder ve elektrofizyolojik deneylerle gösterildiği gibi her iki motor nöronu da çalıştırır. Özetle, tek bir internöronun ablasyonu, bir nöronun kaybını telafi edebilen ve kaçış devresine normal tepkileri geri yükleyebilen iki taraflı bir nöron çifti arasındaki sinaptik rekabeti gösterir.
Introduction
Lazer ablasyon, çok çeşitli organizmalarda nöral devreleri diseksiyon etmek için tercih edilen bir araçtır. Solucanlar ve sinekler gibi model genetik sistemlerde geliştirilen, sinir sisteminin yapısını, işlevini ve gelişimini incelemek için hayvanlar aleminde uygulanmıştır 1,2,3. Burada, Drosophila’da devre montajı sırasında nöronların nasıl etkileşime girdiğini araştırmak için tek nöron ablasyonu kullanıldı. Sineğin kaçış sistemi, analiz için favori bir devredir, çünkü yetişkin sineğin en büyük nöronlarını ve en büyük sinapslarını içerir ve devre son yıllarda iyi karakterize edilmiştir4. Dev Fiber devresinin montajında nöron-nöron etkileşimlerinin oynadığı rol, bu araştırmanın odak noktasıdır.
Hubel ve Wiesel’in 1960’lardaki çalışmalarından bu yana sinirbilimde odak noktası olan bir etkileşim türü “sinaptik rekabet”tir5,6. Bu protokolde, fenomenin moleküler temellerinin keşfedilebileceği Drosophila’nın dev lif sisteminde (GFS) tek hücreli ablasyon yoluyla rekabetin rolünü yeniden gözden geçirmek için lazer ablasyon kullanıldı.
Gelişmekte olan sinekteki nöronların ablasyonu, hedef nöronların görselleştirilmesi, ablasyon yönteminin kesinliği ve numunenin hayatta kalması dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle zor olmuştur. GFS’deki bu problemlerin üstesinden gelmek için, ilgilenilen nöronları etiketlemek için UAS / Gal4 sistemi7 kullanıldı ve presinaptik dev lifi veya postsinaptik sıçrama motor nöronunu (TTMn) çıkarmak için iki fotonlu bir mikroskop kullanıldı.
Bu çalışmada, komşu bilateral nöronların GFS’deki sinaptik bağlantıyı ve sinaptik gücü ayarlamada oynadığı rolü belirlemek için, bilateral nöron çiftlerinden biri (presinaptik GF veya postsinaptik motor nöron) pupa gelişiminden hemen önce silindi. Bu gelişim aşamasında, GF aksonogenezi tamamlanmamıştır8. Yetişkindeki sinaptik devrenin GF yapısı ve işlevi daha sonra incelendi ve kalan GF’nin çıktısına özellikle dikkat edildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
2 fotonlu bir mikroskop ile hücre ablasyonunun, Drosophila’da nöronal devre gelişimini manipüle etmek için oldukça başarılı bir yöntem olduğu kanıtlandı. Bu yöntem non-invaziv olduğu için hayvana minimum zarar verir. Veriler, bilinen devrelerin bu hücreye özgü manipülasyonunun kullanışlılığını desteklemektedir.
Ablasyonun başarısı için en uygun Gal4 sürücüsünü seçmek çok önemliydi. GFS iyi çalışıldığından, birçok özel Gal4 sürücü hatt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
2 foton mikroskobu üzerinde deneyler FAU Stiles-Nicholson Beyin Enstitüsü İleri Hücre Görüntüleme Çekirdeği’nde gerçekleştirildi. Jüpiter Yaşam Bilimleri Girişimi’ne finansal destek için teşekkür ederiz.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
References
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92 (2014).
- Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
- Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. 47, e2412 (2011).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. 52, e3080 (2011).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
- Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), (2018).
- Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).
.