Лазерная абляция клеток у интактных личинок дрозофилы выявила синаптическую конкуренцию
Summary
Этот протокол демонстрирует лазерную клеточную абляцию отдельных нейронов у интактных личинок дрозофилы . Метод позволяет изучить эффект снижения конкуренции между нейронами в развивающейся нервной системе.
Abstract
Протокол описывает однонейронную абляцию с помощью 2-фотонной лазерной системы в центральной нервной системе (ЦНС) интактных личинок Drosophila melanogaster . Используя этот неинвазивный метод, развивающаяся нервная система может быть манипулирована клеточно-специфическим образом. Нарушение развития отдельных нейронов в сети может быть использовано для изучения того, как нервная система может компенсировать потерю синаптического входа. Отдельные нейроны были специально удалены в системе гигантских волокон дрозофилы, с акцентом на два нейрона: пресинаптическое гигантское волокно (GF) и постсинаптический терготровертельный моторный нейрон (TTMn). GF синапсируется с ипсилатеральным TTMn, который имеет решающее значение для реакции побега. Удаление одной из GF в мозге3-го возраста, сразу после того, как GF начинает рост аксонов, навсегда удаляет клетку во время развития ЦНС. Оставшаяся GF реагирует на отсутствующего соседа и образует эктопическую синаптическую окончанию к контралатеральной TTMn. Этот атипичный, билатерально симметричный терминал иннервирует оба ТТМ, как показано на примере связи красителя, и приводит в движение оба моторных нейрона, как показывают электрофизиологические анализы. Таким образом, абляция одного интернейрона демонстрирует синаптическую конкуренцию между двусторонней парой нейронов, которая может компенсировать потерю одного нейрона и восстановить нормальные реакции на цепь побега.
Introduction
Лазерная абляция является предпочтительным инструментом для препарирования нейронных цепей в самых разных организмах. Разработанная в модельных генетических системах, таких как черви и мухи, она была применена в животном мире для изучения структуры, функций и развития нервной системы 1,2,3. Здесь абляция одного нейрона была использована для изучения того, как нейроны взаимодействуют во время сборки цепи у дрозофилы. Система побега мухи является излюбленной схемой для анализа, потому что она содержит самые большие нейроны и самые большие синапсы у взрослой мухи, и эта цепь была хорошо охарактеризована впоследние десятилетия. Роль, которую нейрон-нейронные взаимодействия играют в сборке цепи гигантского волокна, находится в центре внимания данного исследования.
Одним из видов взаимодействия, который был в центре внимания нейробиологии со времен работы Хьюбела и Визеля в 1960-х годах, является «синаптическая конкуренция». В этом протоколе лазерная абляция была использована для того, чтобы пересмотреть роль конкуренции через одноклеточную абляцию в системе гигантских волокон (GFS) дрозофилы, где могут быть обнаружены молекулярные основы этого явления.
Абляция нейронов у развивающейся мухи была затруднена по целому ряду причин, в том числе из-за визуализации целевых нейронов, точности метода абляции и выживаемости образца. Чтобы преодолеть эти проблемы в GFS, система UAS/Gal4 7 была использована для маркировки интересующих нейронов, а двухфотонный микроскоп был использован для удаления пресинаптического гигантского волокна или постсинаптического прыгающего моторного нейрона (TTMn).
В этом исследовании, чтобы определить роль, которую соседние двусторонние нейроны играют в корректировке синаптической связи и синаптической силы в GFS, одна из билатеральных пар нейронов (либо пресинаптическая GF, либо постсинаптическая моторная нейрона) была удалена непосредственно перед развитием куколки. На этой стадии развития аксоногенез GF еще не завершен8. Затем были изучены структура GF и функция синаптической цепи у взрослого человека, при этом особое внимание было уделено выходу оставшейся GF.
Protocol
Representative Results
Discussion
Клеточная абляция с помощью 2-фотонного микроскопа оказалась весьма успешным методом манипулирования развитием нейронных цепей у дрозофил. Так как этот метод является неинвазивным, он наносит минимальный ущерб животному. Полученные данные подтверждают полезность этого специфич…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эксперименты с 2-фотонным микроскопом проводились в FAU Stiles-Nicholson Brain Institute Advanced Cell Imaging Core. Мы хотели бы поблагодарить инициативу Jupiter Life Science за финансовую поддержку.
Materials
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jaxkson ImmunoResearch | 111-545-003 | |
| Anti-green fluorescent protein, rabbit | Fisher Scientific | A11122 | 1:500 concentration |
| Apo LWD 25x/1.10W Objective | Nikon | MRD77220 | water immersion long working distance |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B4287-25G | |
| Chameleon Ti:Sapphire Vision II Laser | Coherent | ||
| Cotton Ball | Genesee Scientific | 51-101 | |
| Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, Lysine Fixable (fluoro-Ruby) | Fisher Scientific | D1817 | |
| Drosophila saline | recipe from Gu and O'Dowd, 2006 | ||
| Ethyl Ether | Fisher Scientific | E134-1 | Danger, Flammable liquid |
| Fly food B (Bloomington recipe) | LabExpress | 7001-NV | |
| Methyl salicylate | Fisher Scientific | O3695-500 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | Eppendorf | 22363204 | |
| Microscope cover-slip 18×18 #1.5 | Fisher Scientific | 12-541A | |
| Neurobiotin Tracer | Vector Laboratories | SP-1120 | |
| Nikon A1R multi-photon microscope | Nikon | on an upright FN1 microsope stand | |
| NIS Elements Advanced Research | Nikon | Acquisition and data analysis software | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | T353-500 | |
| PBS (Phosphate Buffered Salin) | Fisher BioReagents | BP2944-100 | Tablets |
| R91H05-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 40594 | |
| shakB(lethal)-GAl4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 51633 | |
| Superfrost microscope glass slide | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 422355000 | detergent solution |
| UAS-10xGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | 32185 |
References
- Chung, S. H., Mazur, E. Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies. Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).
- Bower, D. V., et al. Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission. BMC Biol. 12, 92 (2014).
- Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).
- Hubel, D. H., Wiesel, T. N. Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint. J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).
- Wiesel, T. N., Hubel, D. H. Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens. J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster. J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae. Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).
- Bainbridge, S. P., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster. J Vis Exp. 47, e2412 (2011).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection. J Vis Exp. 52, e3080 (2011).
- Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study. J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).
- Kennedy, T., Broadie, K. Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit. eNeuro. 5 (6), (2018).
- Mcfarland, B. W., et al. Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli. bioRxiv. , (2024).
.